The Calvin-Benson-Bassham cycle (Calvin cycle) catalyzes virtually all primary productivity on Earth and is the major sink for atmospheric CO 2 . A less appreciated function of CO 2 fixation is as an electron-accepting process. It is known that anoxygenic phototrophic bacteria require the Calvin cycle to accept electrons when growing with light as their sole energy source and organic substrates as their sole carbon source. However, it was unclear why and to what extent CO 2 fixation is required when the organic substrates are more oxidized than biomass. To address these questions we measured metabolic fluxes in the photosynthetic bacterium Rhodopseudomonas palustris grown with 13 C-labeled acetate. R. palustris metabolized 22% of acetate provided to CO 2 and then fixed 68% of this CO 2 into cell material using the Calvin cycle. This Calvin cycle flux enabled R. palustris to reoxidize nearly half of the reduced cofactors generated during conversion of acetate to biomass, revealing that CO 2 fixation plays a major role in cofactor recycling. When H 2 production via nitrogenase was used as an alternative cofactor recycling mechanism, a similar amount of CO 2 was released from acetate, but only 12% of it was reassimilated by the Calvin cycle. These results underscore that N 2 fixation and CO 2 fixation have electron-accepting roles separate from their better-known roles in ammonia production and biomass generation. Some nonphotosynthetic heterotrophic bacteria have Calvin cycle genes, and their potential to use CO 2 fixation to recycle reduced cofactors deserves closer scrutiny.

Abstract Denitrification is a form of anaerobic respiration wherein nitrate (NO 3 - ) is sequentially reduced via nitrite (NO 2 - ), nitric oxide, and nitrous oxide (N 2 O) to dinitrogen gas (N 2 ) by four reductase enzymes. Partial denitrifying bacteria possess only one, or some, of these four reductases and use them as independent respiratory modules. However, it is unclear if partial denitrifiers sense and respond to denitrification intermediates outside of their reductase repertoire. Here we tested the denitrifying capabilities of two purple nonsulfur bacteria, Rhodopseudomonas palustris CGA0092 and Rhodobacter capsulatus SB1003. Each had denitrifying capabilities that matched their genome annotation; CGA0092 reduced NO 2 - to N 2 and SB1003 reduced N 2 O to N 2 . For each bacterium, N 2 O reduction could be used for both electron balance during growth on electron-rich organic compounds in light and for energy transformation via respiration in the dark. However, N 2 O reduction required supplementation with a denitrification intermediate, including those for which there was no associated denitrification enzyme. For CGA0092, NO 3 - served as a stable, non-catalyzable molecule that was sufficient to activate N 2 O reduction. Using a β-galactosidase reporter we found that NO 3 - acted, at least in part, by stimulating N 2 O reductase gene expression. In SB1003, NO 2 - , but not NO 3 - , activated N 2 O reduction but NO 2 - was slowly removed, likely by a promiscuous enzyme activity. Our findings reveal that partial denitrifiers can still be subject to regulation by denitrification intermediates that they cannot use. Importance Denitrification is a form of microbial respiration wherein nitrate is converted via several nitrogen oxide intermediates into harmless dinitrogen gas. Partial denitrifying bacteria, which individually have some but not all denitrifying enzymes, can achieve complete denitrification as a community by cross-feeding nitrogen oxide intermediates. However, the last intermediate, nitrous oxide (N 2 O), is a potent greenhouse gas that often escapes, motivating efforts to understand and improve the efficiency of denitrification. Here we found that at least some partial denitrifying N 2 O reducers can sense and respond to nitrogen oxide intermediates that they cannot otherwise use. The regulatory effects of nitrogen oxides on partial denitrifiers are thus an important consideration in understanding and applying denitrifying bacterial communities to combat greenhouse gas emissions.

Vibrio natriegens has recently emerged as an alternative to Escherichia coli for molecular biology and biotechnology, but low-efficiency genetic tools hamper its development. Here, we uncover how to induce natural competence in V. natriegens and describe methods for multiplex genome editing by natural transformation (MuGENT). MuGENT promotes integration of multiple genome edits at high-efficiency on unprecedented timescales. Also, this method allows for generating highly complex mutant populations, which can be exploited for metabolic engineering efforts. As a proof-of-concept, we attempted to enhance production of the value added chemical poly-β-hydroxybutyrate (PHB) in V. natriegens by targeting the expression of nine genes involved in PHB biosynthesis via MuGENT. Within 1 week, we isolated edited strains that produced ~100 times more PHB than the parent isolate and ~3.3 times more than a rationally designed strain. Thus, the methods described here should extend the utility of this species for diverse academic and industrial applications.

Interactive microbial communities are ubiquitous, influencing biogeochemical cycles and host health. One widespread interaction is nutrient exchange, or cross-feeding, wherein metabolites are transferred between microbes. Some cross-fed metabolites, such as vitamins, amino acids, and ammonium (NH4+), are communally valuable and impose a cost on the producer. The mechanisms that enforce cross-feeding of communally valuable metabolites are not fully understood. Previously we engineered mutualistic cross-feeding between N2-fixing Rhodopseudomonas palustris and fermentative Escherichia coli . Engineered R. palustris excreted essential nitrogen as NH4+ to E. coli while E. coli excreted essential carbon as fermentation products to R. palustris . Here, we enriched for nascent cross-feeding in cocultures with wild-type R. palustris , not known to excrete NH4+. Emergent NH4+ cross-feeding was driven by adaptation of E. coli alone. A missense mutation in E. coli NtrC, a regulator of nitrogen scavenging, resulted in constitutive activation of an NH4+ transporter. This activity likely allowed E. coli to subsist on the small amount of leaked NH4+ and better reciprocate through elevated excretion of organic acids from a larger E. coli population. Our results indicate that enhanced nutrient uptake by recipients, rather than increased excretion by producers, is an underappreciated yet possibly prevalent mechanism by which cross-feeding can emerge.

The phototrophic purple nonsulfur bacterium Rhodopseudomonas palustris is known for its metabolic versatility and is of interest for various industrial and environmental applications. Despite decades of research on R. palustris growth under diverse conditions, patterns of R. palustris growth and carbon utilization with mixtures of carbon substrates remain largely unknown. R. palustris readily utilizes most short chain organic acids but cannot readily use lactate as a sole carbon source. Here we investigated the influence of mixed-substrate utilization on phototrophic lactate consumption by R. palustris. We found that lactate was simultaneously utilized with a variety of other organic acids and glycerol in time frames that were insufficient for R. palustris growth on lactate alone. Thus, lactate utilization by R. palustris was expedited by its co-utilization with additional substrates. Separately, experiments using carbon pairs that did not contain lactate revealed acetate-mediated inhibition of glycerol utilization in R. palustris. This inhibition was specific to the acetate-glycerol pair, as R. palustris simultaneously utilized acetate or glycerol when either was paired with succinate or lactate. Overall, our results demonstrate that (i) R. palustris commonly employs simultaneous mixed-substrate utilization, (ii) mixed-substrate utilization expands the spectrum of readily utilized organic acids in this species, and (iii) R. palustris has the capacity to exert carbon catabolite control in a substrate-specific manner.

Bacteria predominantly exist as members of surfaced-attached communities known as biofilms. Many bacterial species initiate biofilms and adhere to each other using cell surface adhesins. This is the case for numerous ecologically diverse α-proteobacteria, which use polar exopolysaccharide adhesins for cell-cell adhesion and surface attachment. Here, we show that Rhodopseudomonas palustris, a metabolically versatile member of the α-proteobacterial order Rhizobiales, encodes a functional unipolar polysaccharide (UPP) biosynthesis gene cluster. Deletion of genes predicted to be critical for UPP biosynthesis and export abolished UPP production. We also found that R. palustris uses UPP to mediate biofilm formation across diverse photoheterotrophic growth conditions, wherein light and organic substrates are used to support growth. However, UPP was less important for biofilm formation during photoautotrophy, where light and CO2 support growth, and during aerobic respiration with organic compounds. Expanding our analysis beyond R. palustris, we examined the phylogenetic distribution and genomic organization of UPP gene clusters among Rhizobiales species that inhabit diverse niches. Our analysis suggests that UPP is a conserved ancestral trait of the Rhizobiales but that it has been independently lost multiple times during the evolution of this clade, twice coinciding with adaptation to intracellular lifestyles within animal hosts.

Abstract Many mutualistic microbial relationships are based on nutrient cross-feeding. Traditionally, cross-feeding is viewed as being unidirectional from the producer to the recipient. This is likely true when a producer’s metabolic waste, such as fermentation products, provides carbon for a recipient. However, in some cases the cross-fed nutrient holds value for both the producer and the recipient. In such cases, there is potential for nutrient reacquisition by producer cells in a population, leading to competition against recipients. Here we investigate the consequences of inter-partner competition for cross-fed nutrients on mutualism dynamics using an anaerobic coculture pairing fermentative Escherichia coli and phototrophic Rhodopseudomonas palustris . In this coculture, E. coli excretes waste organic acids that provide carbon for R. palustris . In return, R. palustris cross-feeds E. coli ammonium (NH 4 + ), a valuable nitrogen compound that both species prefer. To explore the potential for inter-partner competition, we first used a kinetic model to simulate cocultures with varied affinities for NH 4 + in each species. The model predicted that inter-partner competition for cross-fed NH 4 + could profoundly impact population dynamics. We then experimentally tested the predictions by culturing mutants lacking NH 4 + transporters in both NH 4 + competition assays and cooperative cocultures. Both theoretical and experimental results indicated that the recipient must have a competitive advantage in acquiring valuable cross-fed NH 4 + to avoid collapse of the mutualism. Thus, the very metabolites that form the basis for cooperative cross-feeding can also be subject to competition between mutualistic partners. Significance Mutualistic relationships, particularly those based on nutrient cross-feeding, promote stability of diverse ecosystems and drive global biogeochemical cycles. Cross-fed nutrients within these systems can be either waste products valued only by one partner or nutrients that both partners value. Here, we explore how inter-partner competition for a communally-valuable cross-fed nutrient impacts mutualism dynamics. We discovered that mutualism stability necessitates that the recipient have a competitive advantage against the producer in obtaining the cross-fed nutrient. We propose that the requirement for recipient-biased competition is a general rule for mutualistic coexistence based on the transfer of communally valuable resources, microbial or otherwise.

Abstract The bacterium Zymomonas mobilis naturally produces ethanol at near theoretical maximum yields, making it of interest for industrial ethanol production. Z. mobilis requires the vitamin pantothenate for growth. Here we characterized the genetic basis for the Z. mobilis pantothenate auxotrophy. We found that this auxotrophy is due to the absence of a single gene, panD , encoding aspartate-decarboxylase. Heterologous expression of Escherichia coli PanD in Z. mobilis or supplementation of the growth medium with the product of PanD activity, β-alanine, eliminated the need for exogenous pantothenate. We also determined that IlvC, an enzyme better known for branched-chain amino acid synthesis, is required for pantothenate synthesis in Z. mobilis , as it compensates for the absence of PanE, another pantothenate synthesis pathway enzyme. In addition to contributing to an understanding of the nutritional requirements of Z. mobilis , our results have led to the design of a more cost-effective growth medium.

ABSTRACT In diverse bacteria, proper cellular physiology requires the utilization of protein- or membrane-bound compartments that afford specific metabolic capabilities. One such compartment is the light-harvesting intracytoplasmic membrane (ICM) of purple nonsulfur bacteria (PNSB). Here we reveal that ICMs are subject to differential spatial organization among PNSB. We visualized ICMs in live cells of fourteen PNSB species by exploiting the natural autofluorescence of the photosynthetic machinery. We then quantitatively characterized ICM localization using automated computational analysis of autofluorescence patterns within single cells across the population. Our studies revealed that ICMs are localized in distinct subcellular patterns that differ between species; some PNSB elaborate ICMs throughout the cell, while others spatially restrict ICM to varying degrees. The most highly-restricted ICMs were localized in a specific pattern corresponding to progression of cell growth and division. An identical pattern of ICM restriction was conserved across at least two genera. Phylogenetic and phenotypic comparisons established that ICM localization and ICM architecture are not strictly interdependent and that neither trait fully correlates with the evolutionary relatedness of the species. This discovery of new diversity in bacterial cell organization has implications for understanding both the mechanisms underpinning spatial arrangement of bacterial compartments and the potential benefits of adopting different spatiotemporal patterns.

Microbial mutualistic cross-feeding interactions are ubiquitous and can drive important community functions. Engaging in cross-feeding undoubtedly affects the physiology and metabolism of individual species involved. However, the nature in which an individual's physiology is influenced by cross-feeding and the importance of those physiological changes for the mutualism have received little attention. We previously developed a genetically tractable coculture to study bacterial mutualisms. The coculture consists of fermentative Escherichia coli and phototrophic Rhodopseudomonas palustris. In this coculture, E. coli anaerobically ferments sugars into excreted organic acids as a carbon source for R. palustris. In return, a genetically-engineered R. palustris constitutively converts N2 into NH4+, providing E. coli with essential nitrogen. Using RNA-seq and proteomics, we identified transcript and protein levels that differ in each partner when grown in coculture versus monoculture. When in coculture with R. palustris, E. coli gene expression changes resembled a nitrogen starvation response under the control of the transcriptional regulator NtrC. By genetically disrupting E. coli NtrC, we determined that a nitrogen starvation response is important for a stable coexistence, especially at low R. palustris NH4+ excretion levels. Destabilization of the nitrogen starvation regulatory network resulted in population heterogeneity and in some cases, extinction. Our results highlight that alternative physiological states can be important for survival within cooperative cross-feeding relationships.