Abstract Baloxavir acid (BXA), derived from the prodrug baloxavir marboxil (BXM), potently and selectively inhibits the cap-dependent endonuclease within the polymerase PA subunit of influenza A and B viruses. In clinical trials, single doses of BXM profoundly decrease viral titers as well as alleviating influenza symptoms. Here, we characterize the impact on BXA susceptibility and replicative capacity of variant viruses detected in the post-treatment monitoring of the clinical studies. We find that the PA I38T substitution is a major pathway for reduced susceptibility to BXA, with 30- to 50-fold and 7-fold EC 50 changes in A and B viruses, respectively. The viruses harboring the I38T substitution show severely impaired replicative fitness in cells, and correspondingly reduced endonuclease activity in vitro . Co-crystal structures of wild-type and I38T influenza A and B endonucleases bound to BXA show that the mutation reduces van der Waals contacts with the inhibitor. A reduced affinity to the I38T mutant is supported by the lower stability of the BXA-bound endonuclease. These mechanistic insights provide markers for future surveillance of treated populations.

Systemic light chain (LC) amyloidosis (AL) is a disease where organs are damaged by an overload of a misfolded patient-specific antibody-derived LC, secreted by an abnormal B cell clone. The high LC concentration in the blood leads to amyloid deposition at organ sites. Indeed, cryogenic electron microscopy (cryo-EM) has revealed unique amyloid folds for heart-derived fibrils taken from different patients. Here, we present the cryo-EM structure of heart-derived AL amyloid (AL59) from another patient with severe cardiac involvement. The double-layered structure displays a u-shaped core that is closed by a β-arc lid and extended by a straight tail. Noteworthy, the fibril harbours an extended constant domain fragment, thus ruling out the variable domain as sole amyloid building block. Surprisingly, the fibrils were abundantly concatenated with a proteinaceous polymer, here identified as collagen VI (COLVI) by immuno-electron microscopy (IEM) and mass-spectrometry. Cryogenic electron tomography (cryo-ET) showed how COLVI wraps around the amyloid forming a helical superstructure, likely stabilizing and protecting the fibrils from clearance. Thus, here we report structural evidence of interactions between amyloid and collagen, potentially signifying a distinct pathophysiological mechanism of amyloid deposits. Here the authors report the cryo-EM structure of heart-derived fibrils of an AL amyloidosis patient. Surprisingly, the fibrils form helical superstructures with collagen VI, potentially signifying a distinct pathophysiological mechanism for amyloidoses.

Abstract The broad-spectrum antiviral pseudobase T705, a fluorinated pyrazinecarboxamide, is incorporated via its triphosphate form into nascent viral RNA by viral RNA-dependent RNA polymerases. Since it mimics guanine or adenine it can act as a mutagen, whereas consecutive incorporation leads to chain termination. Here we examine the structural basis for incorporation and stalling for the case of influenza polymerase, using T1106-TP, the nucleotide form of T1105, the de-fluoro analogue of T705. We used a specially designed template that allows single T1106-MP incorporation at a defined site followed by consecutive T1106-MP incorporation and stalling four nucleotides later, as demonstrated by biochemical analysis. A high-resolution cryoEM structure of influenza A/H7N9 polymerase, stalled after transcribing this template, revealed that the entire product-template duplex has backtracked by five nucleotides. Consequently, the singly incorporated T1106-MP resides at the +1 position and forms an unexpected wobble base-pair with a U in the template. The relative stability of the canonical and wobble T1106:U base-pairs in different contexts is investigated by molecular dynamics simulations. Using a different template and influenza B polymerase we also observe stalling after double incorporation of T1106-MP and structural analysis showed again that backtracking occurs, this time by four nucleotides. These results show that, at least in early elongation, consecutive T1106-MP incorporation into the product destabilises the proximal end of the product-template duplex, promoting irreversible backtracking until a more favourable overall configuration is achieved. These results give new insight into the unusual mechanism of chain termination by pyrazinecarboxamide base analogues.

Lysine-specific demethylase 1 (LSD1 or KDM1A) has emerged as a critical mediator of tumor progression in metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC). Among mCRPC subtypes, neuroendocrine prostate cancer (NEPC) is an exceptionally aggressive variant driven by lineage plasticity, an adaptive resistance mechanism to androgen receptor axis-targeted therapies. Our study shows that LSD1 expression is elevated in NEPC and associated with unfavorable clinical outcomes. Using genetic approaches, we validated the on-target effects of LSD1 inhibition across various models. We investigated the therapeutic potential of bomedemstat, an orally bioavailable, irreversible LSD1 inhibitor with low nanomolar potency. Our findings demonstrate potent antitumor activity against CRPC models, including tumor regressions in NEPC patient-derived xenografts. Mechanistically, our study uncovers that LSD1 inhibition suppresses the neuronal transcriptional program by downregulating ASCL1 through disrupting LSD1:INSM1 interactions and de-repressing YAP1 silencing. Our data support the clinical development of LSD1 inhibitors for treating CRPC, especially the aggressive NE phenotype.

Abstract Immunoglobulin light chain amyloidosis (AL) shares with multiple myeloma (MM) the overproduction of one clonal light chain (LC), but whereas in MM patients LC molecules remain soluble in circulation, AL LCs misfold into toxic soluble species and amyloid fibrils that accumulate in internal organs, leading to completely different clinical manifestations. The large sequence variability of LCs has hampered our understanding of the mechanism leading to LC aggregation. Nevertheless, some biochemical properties associated with AL-LC are emerging. The stability of the dimeric LCs seems to play a role, but conformational dynamics and susceptibility to proteolysis have been identified as biophysical parameters that, under native conditions, can better distinguish AL-LCs from LCs found in MM. In this study, our goal was to delineate a conformational fingerprint that could discriminate AL from MM LCs. By subjecting four AL and two MM LCs to in vitro analysis under native conditions using small-angle X-ray scattering (SAXS), we observed that the AL LCs exhibited a slightly larger radius of gyration and greater deviation from the experimentally determined structure, indicating enhanced conformational dynamics. Integrating SAXS with molecular dynamics (MD) simulations to generate a conformational ensemble revealed that LCs can adopt multiple states, with VL and CL domains either bent or straight. AL-LCs favored a distinct state in which both domains were in a straight conformation, maximizing solvent accessibility at their relative interfaces. This unique conformation was experimentally validated by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry (HDX-MS). Such findings reconcile a wealth of experimental observations and provide a precise structural target for drug design investigations. Significance Statement The high sequence variability of antibody light chains complicates the understanding of the molecular determinants of their aggregation in AL patients. Extensive biophysical and structural analyses by our group and others have demonstrated that reduced kinetic and thermodynamic stability associated with higher conformational dynamics play a role in their amyloidogenic behavior, but specific structural elements contributing to these behaviors remain elusive. In addition, these features are not universal among all known LCs, fostering different interpretations of their aggregation mechanisms. By combining molecular dynamics simulations, small-angle X-ray scattering measurements, and hydrogen-deuterium mass exchange spectrometry, we found that enhanced conformational dynamics localized at CL-VL interface residues, coupled with structural expansion, are distinguishing features of amyloidogenic LCs.

ABSTRACT AA amyloidosis is a systemic disease characterized by deposition of misfolded serum amyloid A protein (SAA) into cross-β amyloid in multiple organs in humans and animals. AA amyloidosis occurs at high SAA serum levels during chronic inflammation. The disease can be transmitted horizontally, likely facilitated by prion-like mechanism, in captive animals leading to extreme disease prevalence, e.g. 70% in captive cheetah and 57-73% in domestic short hair (DSH) cats kept in shelters. Herein, we present the 3.3 Å cryo-EM structure of an AA amyloid extracted post-mortem from the kidney of a DSH cat with renal failure. The structure reveals a cross-β architecture assembled from two 76-residue long proto-filaments. Despite >70% sequence homology to mouse and human SAA, the cat SAA variant adopts a distinct amyloid fold. Based on shared disease profiles and almost identical protein sequences, we propose a similar amyloid fold of deposits identified previously in captive cheetah.