Abstract Background Brain banks provide small tissue samples to researchers, while gross anatomy laboratories could provide larger samples, including complete brains to neuroscientists. However, they are preserved with solutions appropriate for gross-dissection, different from the classic neutral-buffered formalin (NBF) used in brain banks. Our previous work in mice showed that two gross-anatomy laboratory solutions, a saturated-salt-solution (SSS) and an alcohol-formaldehyde-solution (AFS), preserve antigenicity of the main cellular markers. Our goal is now to compare the quality of histology and antigenicity preservation of human brains fixed with NBF by immersion (practice of brain banks) vs. those fixed with a SSS and an AFS by whole body perfusion, practice of gross-anatomy laboratories. Methods We used a convenience sample of 42 brains (31 males, 11 females; 25-90 years old) fixed with NBF (N=12), SSS (N=13), and AFS (N=17). One cm 3 tissue blocks were cut, cryoprotected, frozen and sliced into 40 μm sections. The four cell populations were labeled using immunohistochemistry (neuronal-nuclei (NeuN), glial-fibrillary-acidic-protein (GFAP), ionized-calcium-binding-adaptor-molecule1 (Iba1) and myelin-proteolipid-protein (PLP)). We qualitatively assessed antigenicity and cell distribution, and compared the ease of manipulation of the sections, the microscopic tissue quality, and the quality of common histochemical stains (e.g., Cresyl violet, Luxol fast blue, etc.) across solutions. Results Sections of SSS-fixed brains were more difficult to manipulate and showed poorer tissue quality than those from brains fixed with the other solutions. The four antigens were preserved, and cell labeling was more often homogenous in AFS-fixed specimens. NeuN and GFAP were not always present in the NBF and SSS samples. Some antigens were heterogeneously distributed in some specimens, independently of the fixative, but an antigen retrieval protocol successfully recovered them. Finally, the histochemical stains were of sufficient quality regardless of the fixative, although neurons were more often paler in SSS-fixed specimens. Conclusion Antigenicity was preserved in human brains fixed with solutions used in human gross-anatomy (albeit the poorer quality of SSS-fixed specimens). For some specific variables, histology quality was superior in AFS-fixed brains. Furthermore, we show the feasibility of frequently used histochemical stains. These results are promising for neuroscientists interested in using brain specimens from anatomy laboratories.

Abstract Immunohistochemical (IHC) and histochemical (HC) staining is widely used for human brains post-fixed in formalin and stored in brain banks worldwide for months, years and decades. Understanding the effect of prolonged post-fixation, postmortem interval (PMI) and age on these staining procedures is important for interpreting their outcomes, thus improving diagnosis and research of brain disorders afflicting millions of world populations. In this study, we performed both IHC and HC staining for prefrontal cortex (PFC) of postmortem human brains post-fixed for 1, 5, 10, 15 and 20 years. A negative correlation was detected between the intensity of neuron marker neuron nuclear specific marker (NeuN), microglia marker ionized calcium-binding adaptor molecule 1 (Iba1), cresyl violet (CV) and Luxol fast blue (LFB) staining versus post-fixation durations. By contrast, a positive correlation was seen between the intensity of astrocyte marker glial fibrillary acidic protein (GFAP) and hemaetoxylin and eosin Y (H&E) staining versus post-fixation durations. No correlation was found between the staining intensity of NeuN, GFAP, Iba1, H&E, CV and LFB versus PMI. Moreover, no correlation was seen between NeuN, Iba1, H&E, CV and LFB, except GFAP, versus age. These data suggest that prolonged post-fixation exerts both positive and negative effects, but age and PMI have limited effects, on these IHC and HC parameters. Hence these differential changes need to be considered in interpretation of the results when using tissues with prolonged post-fixation. Furthermore, if feasible, it is recommended to perform IHC and HC staining for human brains with the same post-fixation time windows and to use the most optimal antibodies to offset its impact on downstream analyses.

ABSTRACT Background Histology remains the gold standard to assess human brain biology, so ex vivo studies using tissue from brain banks are standard practice in neuroscientific research. However, a larger number of specimens could be obtained from gross anatomy laboratories. These specimens are fixed with solutions appropriate for dissections, but whether they also preserve brain tissue antigenicity is unclear. Therefore, we perfused mice brains with solutions used for human body preservation to assess and compare the tissue quality and antigenicity of the main cell populations. Methods 28 C57BL/6J mice were perfused with: 4% formaldehyde (FAS, N=9), salt-saturated solution (SSS, N=9), and alcohol-solution (AS, N=10). The brains were cut into 40μm sections for antigenicity analysis and were assessed by immunohistochemistry of four antigens: neuronal nuclei (NeuN), glial fibrillary acidic protein (GFAP-astrocytes), ionized calcium binding adaptor molecule1 (Iba1-microglia), and myelin proteolipid protein (PLP). We compared the fixatives according to multiple variables: perfusion quality, ease of manipulation, tissue quality, immunohistochemistry quality, and antigenicity preservation. Results The perfusion quality was better using FAS and worse using AS. The manipulation was very poor in SSS brains. FAS and AS fixed brains showed higher tissue and immunohistochemistry quality than the SSS brains. All antigens were readily observed in every specimen, regardless of the fixative solution. Conclusion Solutions designed to preserve specimens for human gross anatomy dissections also preserve tissue antigenicity in different brain cells. This offers opportunities for the use of human brains fixed in gross anatomy laboratories to assess normal or pathological conditions. SIGNIFICANCE STATEMENT Neuroscientists currently obtain tissue samples from brain banks. Alternatively, a much larger amount of tissue may be obtained from bodies donated to gross anatomy laboratories. However, they are preserved with different fixative solutions that are used for dissection purposes. We ignore if these solutions also preserve antigenicity of the main cell populations, essential in neuroscientific research. This work is the first to show that two solutions currently used in human gross anatomy laboratories preserve sufficient histological quality, in addition to preserve antigenicity of the main cell populations of the mice brain. This work opens the door to the use of human brain tissue obtained from anatomy laboratories in neuroscientific research.

MRI-histology correlation studies of the ex vivo brain mostly employ fresh, extracted (ex situ) specimens, aldehyde fixed by immersion. This method entails manipulation of the fresh brain during extraction, introducing several disadvantages: deformation of the specimen prior to MRI acquisition; introduction of air bubbles in the sulci, creating artifacts; and uneven or poor fixation of the deeper regions of the brain. We propose a new paradigm to scan the ex vivo brain, exploiting a technique used by anatomists: fixation by whole body perfusion, which implies fixation of the brain in situ. This allows scanning the brain surrounded by fluids, meninges, and skull, thus preserving the structural relationships of the brain in vivo and avoiding the disadvantages of ex situ scanning. Our aims were: 1) to assess whether months of in situ fixation resulted in a loss of fluid around the brain; 2) to evaluate whether in situ fixation modified antigenicity for myelin and neuron specific marker; 3) to assess whether in situ fixation improved the register of ex vivo brain images to standard neuroanatomical templates in pseudo-Talairach space for morphometry studies. Five head specimens fixed with a saturated sodium chloride solution (a non-standard fixative used in our anatomy laboratory for neurosurgical simulation) were employed. We acquired 3D T1-weighted (MPRAGE), 2D fluid-attenuated inversion recovery T2-weighted turbo spin echo (T2w-FLAIR), and 3D gradient-echo (3D-GRE) pulse sequences of all brains on a 1.5T MRI. After brain extraction, sections were processed for binding with myelin basic protein (MBP) and neuronal nuclei (NeuN) primary antibodies by immunofluorescence. This study showed that all but one specimen retained fluids in the subarachnoid and ventricular spaces. The specimen that lost fluid was the oldest one, with the longest interval between the time of death and the MRI scanning day being 403 days. All T1-weighted images were successfully processed through a validated pipeline used with in vivo MRIs. The pipeline did not require any modification to run on the ex vivo-in situ scans. All scans were successfully registered to the brain template, more accurately than an ex vivo-ex situ scan and exhibited positive antigenicity for MBP and NeuN. MRI and histology study of the ex vivo-in situ brain fixed by perfusion is feasible and allows for in situ MRI imaging for of at least 10 months post-mortem prior to histology analyses. Fluids around and inside the brain specimens and antigenicity for myelin and neurons were all well preserved.### Competing Interest Statement