The most polymorphic gene family in P. falciparum is the ∼60 var genes distributed across parasite chromosomes, both in the subtelomeres and in internal regions. They encode hypervariable surface proteins known as P. falciparum erythrocyte membrane protein 1 (PfEMP1) that are critical for pathogenesis and immune evasion in Plasmodium falciparum. How var gene sequence diversity is generated is not currently completely understood. To address this, we constructed large clone trees and performed whole genome sequence analysis to study the generation of novel var gene sequences in asexually replicating parasites. While single nucleotide polymorphisms (SNPs) were scattered across the genome, structural variants (deletions, duplications, translocations) were focused in and around var genes, with considerable variation in frequency between strains. Analysis of more than 100 recombination events involving var exon 1 revealed that the average nucleotide sequence identity of two recombining exons was only 63% (range: 52.7–72.4%) yet the crossovers were error-free and occurred in such a way that the resulting sequence was in frame and domain architecture was preserved. Var exon 1, which encodes the immunologically exposed part of the protein, recombined in up to 0.2% of infected erythrocytes in vitro per life cycle. The high rate of var exon 1 recombination indicates that millions of new antigenic structures could potentially be generated each day in a single infected individual. We propose a model whereby var gene sequence polymorphism is mainly generated during the asexual part of the life cycle.

ABSTRACT The population structure of the malaria parasite Plasmodium falciparum can reveal underlying demographic and adaptive evolutionary processes. Here, we analyse population structure in 4,376 P. falciparum genomes from 21 countries across Africa. We identified a strongly differentiated cluster of parasites, comprising ∼1.2% of samples analysed, geographically distributed over 13 countries across the continent. Members of this cluster, named AF1, carry a genetic background consisting of a large number of highly differentiated variants, rarely observed outside this cluster, at a multitude of genomic loci distributed across most chromosomes. At these loci, the AF1 haplotypes appear to have common ancestry, irrespective of the sampling location; outside the shared loci, however, AF1 members are genetically similar to their sympatric parasites. AF1 parasites sharing up to 23 genomic co-inherited regions were found in all major regions of Africa, at locations over 7,000 km apart. We coined the term cryptotype to describe a complex common background which is geographically widespread, but concealed by genomic regions of local origin. Most AF1 differentiated variants are functionally related, comprising structural variations and single nucleotide polymorphisms in components of the MSP1 complex and several other genes involved in interactions with red blood cells, including invasion and erythrocyte antigen export. We propose that AF1 parasites have adapted to some as yet unidentified evolutionary niche, by acquiring a complex compendium of interacting variants that rarely circulate separately in Africa. As the cryptotype spread across the continent, it appears to have been maintained mostly intact in spite of recombination events, suggesting a selective advantage. It is possible that other cryptotypes circulate in Africa, and new analysis methods may be needed to identify them.

While often undetected and untreated, persistent seasonal asymptomatic malaria infections remain a global public health problem. Despite the presence of parasites in the peripheral blood, no symptoms develop. Disease severity is correlated with the levels of infected red blood cells (iRBCs) adhering within blood vessels. Changes in iRBC adhesion capacity have been linked to seasonal asymptomatic malaria infections, however how this is occurring is still unknown. Here, we present evidence that RNA polymerase III (RNA Pol III) transcription in Plasmodium falciparum is downregulated in field isolates obtained from asymptomatic individuals during the dry season. Through experiments with in vitro cultured parasites, we have uncovered an RNA Pol III-dependent mechanism that controls pathogen proliferation and expression of a major virulence factor in response to external stimuli. Our findings establish a connection between P. falciparum cytoadhesion and a non-coding RNA family transcribed by Pol III. Additionally, we have identified P. falciparum Maf1 as a pivotal regulator of Pol III transcription, both for maintaining cellular homeostasis and for responding adaptively to external signals. These results introduce a novel perspective that contributes to our understanding of P. falciparum virulence. Furthermore, they establish a connection between this regulatory process and the occurrence of seasonal asymptomatic malaria infections.

Abstract Experimental studies on the biology of malaria parasites have been mostly based on laboratory-adapted lines, but there is limited understanding of how these may differ from parasites in natural infections. Loss-of-function mutants have previously been shown to emerge during culture of some Plasmodium falciparum clinical isolates, in analyses that focused on single-genotype infections. The present study included a broader array of isolates, mostly representing multiple-genotype infections which are more typical in areas where malaria is highly endemic. Genome sequence data from multiple time points during several months of culture adaptation of 28 West African isolates were analysed, including previously available sequences along with new genome sequences from additional isolates and timepoints. Some genetically complex isolates eventually became fixed over time to single surviving genotypes in culture, whereas others retained diversity although proportions of genotypes varied over time. Drug-resistance allele frequencies did not show overall directional changes, suggesting that resistance-associated costs are not the main causes of fitness differences among parasites in culture. Loss-of-function mutants emerged during culture in several of the multiple-genotype isolates, affecting genes (including AP2-HS, EPAC and SRPK1 ) for which loss-of-function mutants were previously seen to emerge in single-genotype isolates. Parasite clones were derived by limiting dilution from six of the isolates, and sequencing identified de novo variants not detected in the bulk isolate sequences. Interestingly, most of these were nonsense mutants and frameshifts disrupting the coding sequence of EPAC , the gene with the largest number of independent nonsense mutants previously identified in laboratory-adapted lines. Analysis of Identity-By-Descent to explore relatedness among clones revealed co-occurring non-identical sibling parasites, illustrative of the natural genetic structure within parasite populations.

Abstract While often undetected and untreated, persistent seasonal asymptomatic malaria infections remain a global public health problem. Despite the presence of parasites in the peripheral blood, no symptoms develop. Disease severity is correlated with the levels of infected red blood cells (iRBCs) adhering within blood vessels. Changes in iRBC adhesion capacity has been linked to seasonal asymptomatic malaria infections, however how this is occurring is still unknown. Here we present evidence that RNA polymerase III (RNA Pol III) transcription in Plasmodium falciparum is downregulated in field isolates obtained from asymptomatic individuals during the dry season. Through experiments with in vitro cultured parasites, we have uncovered an RNA Pol III-dependent mechanism that controls pathogen proliferation and expression of a major virulence factor in response to external stimuli. Our findings establish a connection between P. falciparum cytoadhesion and a non-coding RNA family transcribed by Pol III. Additionally, we have identified P. falciparum Maf1 as a pivotal regulator of Pol III transcription, both for maintaining cellular homeostasis and responding adaptively to external signals. These results introduce a novel perspective that contributes to our understanding of P. falciparum virulence. Furthermore, it establishes a connection between this regulatory process and the occurrence of seasonal asymptomatic malaria infections.

Abstract The significance of multiplication rate variation in malaria parasites needs to be determined, particularly for Plasmodium falciparum , the species that causes most virulent infections. To investigate this, parasites from cases presenting to hospital in The Gambia and from local community infections were culture-established and then tested under exponential growth conditions in a standardised six-day multiplication rate assay. The multiplication rate distribution was lower than seen previously in clinical isolates from another area in West Africa where infection is more highly endemic. Multiplication rates were higher in cultured isolates derived from hospital cases ( N = 23, mean = 2.9-fold per 48 h) than in those from community infections ( N = 11, mean = 1.8-fold)(Mann-Whitney P < 0.001). There was a positive correlation between levels of parasitaemia in peripheral blood of sampled individuals and multiplication rates of the isolates in culture (Spearman’s rho = 0.45, P = 0.017). There was no significant difference between isolates containing single parasite genotypes or multiple genotypes at the time of assay, suggesting that parasites do not modify their multiplication rates in response to the presence of different genotypes. It will be important to uncover the mechanisms of this intrinsic multiplication rate variation, and to also investigate the epidemiological distribution and potential associations with infection phenotypes in other populations.

Abstract Among the ∼200 Plasmodium species that infect vertebrates, six infect humans. Of these, P. falciparum causes >95% of all ∼500,000 annual fatalities. Phylogenetically, P. falciparum belongs to the Laverania subgenus, a group of Plasmodium species that infect great apes. Common to Laverania species is the family of FIKK kinases. One million years ago, a single FIKK kinase conserved in all Plasmodium species gained an export element in the Laverania subgenus and expanded into the family of ∼20 atypical FIKK kinases, most of which are exported into the host cell. The fikk genes are conserved in syntenic loci across the Laverania , arguing for a rapid expansion controlling important functions in host cell remodelling and pathogenesis. We provide evidence that the FIKK paralogues evolved specific and mutually exclusive phosphorylation motif preferences, conserved across their Laverania orthologues, in a short evolutionary timeframe. Surprisingly, we find that FIKK13 has evolved exclusive tyrosine-phosphorylation preference, which was thought to be absent in Plasmodium species. Combining a crystal structure with AlphaFold2 predictions, we identify residues that determine kinase-specificity within the FIKK family in a fast-evolving flexible loop. Finally, we show that all expressed members of the FIKK kinase family can be chemically inhibited in vitro using a single compound. Such a pan-specific inhibitor of this kinase family important for virulence could reduce the ability of the parasite to gain escape-mutations and resistance.

Background. Parasite multiplication rates vary among Plasmodium falciparum isolates from patients with malaria, suggesting differences in virulence potential, although direct comparisons between hospital-based clinical cases and community infections are needed. Methods. Cryopreserved blood samples from malaria cases presenting to a district hospital in The Gambia and infections detected in local communities were introduced to continuous culture under the same conditions. Thirty-four isolates (23 hospital-based and 11 community-based) were successfully established and then tested under exponential growth conditions over six days to derive estimated P. falciparum multiplication rates per cycle based on a 48-hour typical cycle length. Results. A range of parasite multiplication rates in culture was seen across isolates, from 1.5-fold to 5.0-fold per cycle. Multiplication rates were significantly higher in the hospital-based isolates than the community-based isolates. There was a significantly positive correlation between parasitaemia in peripheral blood and multiplication rates in culture. There was no significant difference in multiplication rates between isolates with single or multiple parasite genotypes. Conclusions. These findings are consistent with a hypothesis that intrinsic natural variation in parasite multiplication rate may affect levels of parasitaemia achieved during infection, and that this affects likelihood of hospital presentation. Results do not support a hypothesis that parasites modify their multiplication rates in response to competing parasites with different genotypes.

Abstract Pathogen multiplication rate is theoretically an important determinant of virulence, although often poorly understood. We show intrinsic multiplication rate variation of the major human malaria parasite Plasmodium falciparum to be associated with blood-stage infection intensity. A panel of clinical isolates from a highly endemic West African population was analysed repeatedly during five months of continuous culture, showing a range of exponential multiplication rates at all timepoints tested, mean rates increasing over time. All isolates had different genome sequences, many containing within-isolate diversity that decreased over time, but increases in multiplication rates were not primarily attributable to genomic selection. New mutants, including premature stop codons emerging in a few isolates, did not attain sufficiently high frequencies to substantially affect overall multiplication rates. Significantly, multiplication rate variation at each of the cultured timepoints robustly correlated with parasite levels in patients at clinical presentation, indicating parasite control of multiplication that contributes to virulence.