Brain function is mediated by neural circuit connectivity, and elucidating the role of connections is aided by techniques to block their output. We developed cell-type-selective, reversible synaptic inhibition tools for mammalian neural circuits by leveraging G protein signaling pathways to suppress synaptic vesicle release. Here, we find that the pharmacologically selective designer Gi-protein-coupled receptor hM4D is a presynaptic silencer in the presence of its cognate ligand clozapine-N-oxide (CNO). Activation of hM4D signaling sharply reduced synaptic release probability and synaptic current amplitude. To demonstrate the utility of this tool for neural circuit perturbations, we developed an axon-selective hM4D-neurexin variant and used spatially targeted intracranial CNO injections to localize circuit connections from the hypothalamus to the midbrain responsible for feeding behavior. This synaptic silencing approach is broadly applicable for cell-type-specific and axon projection-selective functional analysis of diverse neural circuits.

Microglia play a key role in shaping the formation and refinement of the excitatory network of the brain. However, less is known about whether and how they organize the development of distinct inhibitory networks. We find that microglia are essential for the proper development of somatostatin-positive (SST+) cell synapses during the second postnatal week. We further identify a pair of molecules that act antagonistically to one another in the organization of SST+ cell axonal elaboration. Whereas CX3CL1 acts to suppress axonal growth and complexity, CXCL12 promotes it. Assessing the functional importance of microglia in the development of cortical activity, we find that a whisker stimulation paradigm that drives SST+ cell activation leads to reduced cortical spiking in brains depleted of microglia. Collectively, our data demonstrate an important role of microglia in regulating the development of SST+ cell output early in life.

Throughout development, neuronal identity is controlled by key transcription factors that determine the unique properties of a cell. During embryogenesis, the transcription factor Prox1 regulates VIP-positive cortical interneuron migration, survival, and connectivity. Here, we explore the role of Prox1 as a regulator of genetic programs that guide the final specification of VIP interneuron subtypes in early postnatal life. Synaptic in vitro electrophysiology in male and female mice shows that postnatal Prox1 removal differentially affects the dynamics of excitatory inputs onto VIP bipolar and multipolar subtypes. RNA sequencing reveals that one of the downstream targets of Prox1 is the postsynaptic protein Elfn1, a constitutive regulator of presynaptic release probability. Further genetic, pharmacological, and electrophysiological experiments demonstrate that removing Prox1 reduces Elfn1 function in VIP multipolar but not in bipolar cells. Finally, overexpression experiments and analysis of native Elfn1 mRNA expression reveal that Elfn1 levels are differentially controlled at the post-transcriptional stage. Thus, in addition to activity-dependent processes that contribute to the developmental trajectory of VIP cells, genetic programs engaged by Prox1 control the final differentiation of multipolar and bipolar subtypes. SIGNIFICANCE STATEMENT The transcription factor Prox1 generates functional diversification of cortical VIP interneuron subtypes in early postnatal life, thus expanding the inhibitory repertoire of the cortex.

Somatostatin (SST) interneurons produce delayed inhibition because of the short-term facilitation of their excitatory inputs created by the expression of metabotropic glutamate receptor 7 (mGluR7) and presynaptic GluK2-containing kainate receptors (GluK2-KARs). Using mice of both sexes, we find that as synaptic facilitation at layer (L)2/3 SST cell inputs increases during the first few postnatal weeks, so does GluK2-KAR expression. Removal of sensory input by whisker trimming does not affect mGluR7 but prevents the emergence of presynaptic GluK2-KARs, which can be restored by allowing whisker regrowth or by acute calmodulin activation. Conversely, late trimming or acute inhibition of Ca 2+ /calmodulin-dependent protein kinase II is sufficient to reduce GluK2-KAR activity. This developmental and activity-dependent regulation also produces a specific reduction of L4 GluK2-KARs that advances in parallel with the maturation of sensory processing in L2/3. Finally, we find that removal of both GluK2-KARs and mGluR7 from the synapse eliminates short-term facilitation and reduces sensory adaptation to repetitive stimuli, first in L4 of somatosensory cortex, then later in development in L2/3. The dynamic regulation of presynaptic GluK2-KARs potentially allows for flexible scaling of late inhibition and sensory adaptation. SIGNIFICANCE STATEMENT Excitatory synapses onto somatostatin (SST) interneurons express presynaptic, calcium-permeable kainate receptors containing the GluK2 subunit (GluK2-KARs), activated by high-frequency activity. In this study we find that their presence on L2/3 SST synapses in the barrel cortex is not based on a hardwired genetic program but instead is regulated by sensory activity, in contrast to that of mGluR7. Thus, in addition to standard synaptic potentiation and depression mechanisms, excitatory synapses onto SST neurons undergo an activity-dependent presynaptic modulation that uses GluK2-KARs. Further, we present evidence that loss of the frequency-dependent synaptic components (both GluK2-KARs and mGluR7 via Elfn1 deletion) contributes to a decrease in the sensory adaptation commonly seen on repetitive stimulus presentation.

Appropriate risk evaluation is essential for survival in complex, uncertain environments. Confronted with choosing between certain (safe) and uncertain (risky) options, animals show strong preference for either option consistently across extended time periods. How such risk preference is encoded in the brain remains elusive. A candidate region is the lateral habenula (LHb), which is prominently involved in value-guided behavior. Here, using a balanced two-alternative choice task and longitudinal two-photon calcium imaging, we identify LHb neurons with risk-preference-selective activity reflecting individual risk preference prior to action selection. By employing whole-brain anatomical tracing, multi-fiber photometry, and projection- and cell-type-specific optogenetics, we find that glutamatergic LHb projections from the medial (MH) but not lateral (LH) hypothalamus provide behavior-relevant synaptic input before action selection. Optogenetic stimulation of MH→LHb axons evoked excitatory and inhibitory postsynaptic responses, whereas LH→LHb projections were excitatory. We thus reveal functionally distinct hypothalamus-habenula circuits for risk preference in habitual economic decision-making.

Abstract The vibrissae system of rodents, akin to human hands and fingers, provides somatosensory information coming from individual whiskers for object exploration and recognition. Just as separated digits enhance somatosensation in humans, the ability of mice to sense objects through multiple whiskers in segregated streams is crucial. The segregation begins at the level of the whiskers and is maintained through their precise somatotopic organization in the Brainstem→ Thalamus→ Cortex axis, culminating in the so-called barrels and the in-between “spaces” called septa. Here, by performing in-vivo silicon probe recordings simultaneously in the barrel and septa domains in mice upon repeated 10Hz single and multi-whisker stimulation, we identify and characterize a temporal divergence in the spiking activity between these domains. Further, through genetic fate-mapping, we reveal that cortical SST+ and VIP+ inhibitory neurons show a layer-dependent differential preference in septa versus barrel domains. Utilizing a genetic manipulation that affects the temporal facilitation dynamics onto only these two inhibitory cell classes, we largely abolish the temporal response divergence between the two cortical domains. Finally, using in-vivo viral tracing, whole-brain clearing and imaging, we show a differential barrel and septa projection pattern to cortical regions S2 and M1. We hence reveal that local temporally engaging cortical inhibition provided by SST+ neurons contribute to the functional segregation of barrel and septa domains and potentially their downstream targets.

Summary Neuronal identity is controlled in multiple developmental steps by key transcription factors that determine the unique properties of a cell. During embryogenesis, the transcription factor Prox1 has been shown to regulate VIP interneuron migration, survival, and as a result, circuit integration. Here, we explore the role of Prox1 as a regulator of genetic programs that guide the final specification of VIP interneuron subtypes in early post-natal life. Using in-vitro electrophysiology we find that post-natal removal of Prox1 differentially affects the synaptic integration of VIP bipolar and multipolar subtypes. RNA sequencing reveals that one of the downstream targets of Prox1 is the postsynaptic protein Elfn1, a constitutive regulator of presynaptic release probability. Genetic, pharmacological and electrophysiological experiments demonstrate that knocking out Prox1 reduces Elfn1 function in VIP multipolar but not in bipolar cells. Thus, in addition to the activity-dependent and contextual processes that finalize developmental trajectories, genetic programs engaged by Prox1 control the differentiation and connectivity of VIP interneuron subtypes.