Summary Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is a complex cellular program proceeding through a hybrid E/M state linked to cancer-associated stemness, migration and chemoresistance. Deeper molecular understanding of this dynamic physiological landscape is needed to define events which regulate the transition and entry into and exit from the E/M state. Here, we quantified >60,000 molecules across ten time points and twelve omic layers in human mammary epithelial cells undergoing TGFβ-induced EMT. Deep proteomic profiles of whole cells, nuclei, extracellular vesicles, secretome, membrane and phosphoproteome defined state-specific signatures and major transition points. Parallel metabolomics showed metabolic reprogramming preceded changes in other layers, while single-cell RNA sequencing identified transcription factors controlling entry into E/M. Covariance analysis exposed unexpected discordance between the molecular layers. Integrative causal modeling revealed co-dependencies governing entry into E/M that were verified experimentally using combinatorial inhibition. Overall, this dataset provides an unprecedented resource on TGFβ signaling, EMT and cancer.

Abstract Determining how DNA variants affect the binding of regulatory complexes to cis-regulatory elements (CREs) and non-coding single-nucleotide polymorphisms (ncSNPs) is a challenge in genomics. To address this challenge, we have developed CASCADE ( C omprehensive AS sessment of C omplex A ssembly at D NA E lements), which is a protein-binding microarray (PBM)-based approach that allows for the high-throughput profiling of cofactor (COF) recruitment to DNA sequence variants. The method also enables one to infer the identity of the transcription factor-cofactor (TF-COF) complexes involved in COF recruitment. We use CASCADE to characterize regulatory complexes binding to CREs and SNP quantitative trait loci (SNP-QTLs) in resting and stimulated human macrophages. By profiling the recruitment of the acetyltransferase p300 and MLL methyltransferase component RBBP5, we identify key regulators of the chemokine CXCL10, and by profiling a set of five functionally diverse COFs we identify a prevalence of ETS sites mediating COF recruitment at SNP-QTLs in macrophages. Our results demonstrate that CASCADE is a customizable, high-throughput platform to link DNA variants with the biophysical complexes that mediate functions such as chromatin modification or remodeling in a cell state-specific manner.

SUMMARY Adaptive immunity and the five vertebrate NF-κB/Rel family members first appeared in cartilaginous fish, suggesting that divergence and specialization within the NF-κB family helped facilitate the evolution of adaptive immunity. One specialized function of the NF-κB c-Rel protein in macrophages is the activation of Il12b , which encodes a key regulator of T-cell development. We found that c-Rel is a far more potent regulator of Il12b than of any other inducible genes in macrophages, with c-Rel regulation of Il12b dependent on its heightened intrinsic DNA-binding affinity. c-Rel homodimers regulate Il12b transcription in part via motifs with little resemblance to canonical NF-κB motifs. ChIP-seq experiments further defined distinct c-Rel DNA-binding preferences genome-wide, and X-ray crystallography of a c-Rel/RelA chimeric protein identified key amino acid changes that support the unique c-Rel properties. Unexpectedly, these changes, along with the c-Rel/RelA binding affinity differences, were largely restricted to mammalian species. Together, our findings reveal how a transcription factor family member can undergo a structural transition at a late stage of vertebrate evolution, resulting in an increased intrinsic DNA binding affinity and with clear functional consequences, presumably to support the increasing complexity of immune regulation.

Abstract Transcription factor (TF)–cofactor (COF) interactions define dynamic, cell-specific networks that govern gene expression; however, these networks are understudied due to a lack of methods for high-throughput profiling of DNA-bound TF–COF complexes. Here, we describe the Cofactor Recruitment (CoRec) method for rapid profiling of cell-specific TF–COF complexes. We define a lysine acetyltransferase (KAT)–TF network in resting and stimulated T cells. We find promiscuous recruitment of KATs for many TFs and that 35% of KAT–TF interactions are condition specific. KAT–TF interactions identify NF-κB as a primary regulator of acutely induced histone 3 lysine 27 acetylation (H3K27ac). Finally, we find that heterotypic clustering of CBP/P300-recruiting TFs is a strong predictor of total promoter H3K27ac. Our data support clustering of TF sites that broadly recruit KATs as a mechanism for widespread co-occurring histone acetylation marks. CoRec can be readily applied to different cell systems and provides a powerful approach to define TF–COF networks impacting chromatin state and gene regulation.

Summary Transcription factor (TF)-cofactor (COF) interactions define dynamic, cell-specific networks that govern gene expression; however, these networks are understudied due to a lack of methods for high-throughput profiling of DNA-bound TF-COF complexes. Here we describe the Co factor Rec ruitment (CoRec) method for rapid profiling of cell-specific TF-COF complexes. We define a lysine acetyltransferase (KAT)-TF network in resting and stimulated T cells. We find promiscuous recruitment of KATs for many TFs and that 35% of KAT-TF interactions are condition specific. KAT-TF interactions identify NF-κB as a primary regulator of acutely induced H3K27ac. Finally, we find that heterotypic clustering of CBP/P300-recruiting TFs is a strong predictor of total promoter H3K27ac. Our data supports clustering of TF sites that broadly recruit KATs as a mechanism for widespread co-occurring histone acetylation marks. CoRec can be readily applied to different cell systems and provides a powerful approach to define TF-COF networks impacting chromatin state and gene regulation.

Abstract Although >90% of somatic mutations reside in non-coding regions, few have been reported as cancer drivers. To predict driver non-coding variants (NCVs), we present a novel transcription factor (TF)-aware burden test (TFA-BT) based on a model of coherent TF function in promoters. We applied our TFA-BT to NCVs from the Pan-Cancer Analysis of Whole Genomes cohort and predicted 2,555 driver NCVs in the promoters of 813 genes across 20 cancer-types. These genes are enriched in cancer-related gene ontologies, essential genes, and genes associated with cancer prognosis. We found that 765 candidate driver NCVs alter transcriptional activity, 510 lead to differential binding of TF-cofactor regulatory complexes, and that they primarily impact the binding of ETS factors. Finally, we show that different NCVs within a promoter often affect transcriptional activity through shared mechanisms. Our integrated computational and experimental approach shows that cancer NCVs are widespread and that ETS factors are commonly disrupted.

Many cnidarians, including the reef-building corals, undergo symbiotic mutualisms with photosynthetic dinoflagellate algae of the family Symbiodiniaceae. These partnerships are sensitive to temperature extremes, which cause symbiont loss and increased coral mortality. Previous studies have implicated host immunity and specifically immunity transcription factor NF-κB as having a role in the maintenance of the cnidarian-algal symbiosis. Here we have further investigated a possible role for NF-κB in establishment and loss of symbiosis in various strains of the anemone Exaiptasia (Aiptasia) and in the coral Pocillopora damicornis. Our results show that NF-κB expression is reduced in Aiptasia larvae and adults that host certain algae strains. Treatment of Aiptasia larvae with a known symbiosis-promoting cytokine, transforming growth factor β, also led to decreased NF-κB expression. We also show that aposymbiotic Aiptasia (with high NF-κB expression) have increased survival following infection with the pathogenic bacterium Serratia marcescens as compared to symbiotic Aiptasia (low NF-κB expression). Furthermore, a P. damicornis coral colony hosting Durusdinium spp. (formerly clade D) symbionts had higher basal NF-κB expression and decreased heat-induced bleaching as compared to two individuals hosting Cladocopium spp. (formerly clade C) symbionts. Lastly, genome-wide gene expression profiling and genomic promoter analysis identified putative NF-κB target genes that may be involved in thermal bleaching, symbiont maintenance, and/or immune protection in P. damicornis. Our results provide further support for the hypothesis that modulation of NF-κB and immunity plays a role in some, but perhaps not all, cnidarian-Symbiodiniaceae partnerships as well as in resistance to pathogens and bleaching.

Abstract In this report, we investigate the evolution of transcription factor NF-κB by examining its structure, activity, and regulation in two protists using phylogenetic, cellular, and biochemical techniques. In Capsaspora owczarzaki ( Co ), we find that full-length NF-κB has an N-terminal DNA-binding domain and a C-terminal Ankyrin (ANK) repeat inhibitory domain, and its DNA-binding activity is more similar to metazoan NF-κB rather than Rel proteins. As with mammalian NF-κB proteins, removal of the ANK repeats is required for Co -NF-κB to enter the nucleus, bind DNA, and activate transcription. However, C-terminal processing of Co -NF-κB is not induced by co-expression of IKK in human cells. Exogenously expressed Co -NF-κB localizes to the nucleus in Co cells. NF-κB mRNA and DNA-binding levels differ across three life stages of Capsaspora , suggesting distinct roles for NF-κB in these life stages. RNA-seq and GO analyses identify possible gene targets and biological functions of Co -NF-κB. We also show that three NF-κB-like proteins from the choanoflagellate Acanthoeca spectabilis ( As ) all consist of primarily the N-terminal conserved Rel Homology domain sequences of NF-κB, and lack C-terminal ANK repeats. All three As -NF-κB proteins constitutively enter the nucleus of human and Co cells, but differ in their DNA-binding and transcriptional activation activities. Furthermore, all three As -NF-κB proteins can form heterodimers, indicating that NF-κB diversified into multi-subunit families at least two times during evolution. Overall, these results present the first functional characterization of NF-κB in a taxonomic kingdom other than Animalia and provide information about the evolution and diversification of this biologically important transcription factor. Significance These results represent the first functional characterization of the biologically important transcription factor NF-κB in a taxonomic kingdom other than Animalia. As such, they provide information on the evolutionary origins and basal diversification of NF-κB outside of metazoans. These results suggest that NF-κB plays life stage-specific roles in Capsaspora , the closest unicellular ancestor to all metazoans. Finally, the analysis of three NF-κB proteins in a single choanoflagellate indicates that choanoflagellates have subclasses of NF-κBs, which can form heterodimers, suggesting that NF-κB subunit expansion and diversification has occurred at least twice in evolution.

Determining the biophysical principles that shape transcription factor (TF) binding in a cell-specific manner is key to quantitative models of gene expression. High-throughput (HT) in vitro methods measuring protein-DNA binding are invaluable for relating TF binding affinity to genome-wide binding; however, the impact of cell-specific post-translational modifications (PTMs) and cofactors are not routinely assessed. To address these limitations, we describe a new HT approach, called nextPBMs (nuclear extract protein-binding microarrays), to characterize TF binding that accounts for PTMs and endogenous cofactors. We use nextPBMs to examine the DNA binding of the lineage factor PU.1/Spi1 and IRF8 in human monocytes. We identify two binding modes for PU.1 in monocytes - autonomous binding unaffected by PTMs and cooperative binding with IRF8, and identify a single cooperative mode for IRF8. We characterize the DNA binding of PU.1:IRF8 complexes, and show how nextPBMs can be used to discover cell-specific cofactors and characterize TF cooperativity at single-nucleotide resolution. We show that chromatin state and cofactors both influence the affinity requirements for PU.1 binding sites. Furthermore, we find that the influences of cooperative (IRF8) and collaborative (C/EBPα) cofactors on PU.1-binding site affinity are independent and additive.

Biological and biochemical functions of immunity transcription factor NF-κB in basal metazoans are largely unknown. Herein, we characterize transcription factor NF-κB from the demosponge Amphimedon queenslandica (Aq), in the phylum Porifera. Structurally and phylogenetically, the Aq-NF-κB protein is most similar to NF-κB p100 and p105 among vertebrate proteins, with an N-terminal DNA-binding/dimerization domain, a C-terminal Ankyrin (ANK) repeat domain, and a DNA binding-site profile more similar to human NF-κB proteins than Rel proteins. Aq-NF-κB also resembles the mammalian NF-κB protein p100 in that C-terminal truncation results in translocation of Aq-NF-κB to the nucleus and increases its transcriptional activation activity. Overexpression of a human or sea anemone IκB kinase (IKK) can induce C-terminal processing of Aq-NF-κB in vivo , and this processing requires C-terminal serine residues in Aq-NF-κB. Unlike human NF-κB p100, however, the C-terminal sequences of Aq-NF-κB do not effectively inhibit its DNA-binding activity when expressed in human cells. Tissue of another demosponge, a black encrusting sponge, contains NF-κB site DNA-binding activity and an NF-κB protein that appears mostly processed and in the nucleus of cells. NF-κB DNA-binding activity and processing is increased by treatment of sponge tissue with LPS. By transcriptomic analysis of A. queenslandica we identified likely homologs to many upstream NF-κB pathway components. These results present a functional characterization of the most ancient metazoan NF-κB protein to date, and show that many characteristics of mammalian NF-κB are conserved in sponge NF-κB, but the mechanism by which NF-κB functions and is regulated in the sponge may be somewhat different.