Abstract Bacillus cereus group or B. cereus sensu lato (s.l.), is comprised of Gram-positive spore-forming, rod-like bacteria that are widespread in natural environments. Although the species in this group are known to be highly related in terms of phenotypic characteristics, they display different levels of pathogenicity. Biochemical assays are therefore considered to be insufficient for accurate taxonomic classification of B. cereus group species. To facilitate accurate taxonomic classification and associated prediction of pathogenic potential, we have conducted comparative genomic analyses of publicly available genome assemblies of B. cereus group isolates. Through that, we found that an isolate previously known as B. mycoides ATCC 21929 was sufficiently distant from valid and effective type strains to be considered a putative new species. We have conducted biochemical and bioinformatic characterization of strain ATCC 21929 that had been isolated from soil in Papua New Guinea. Strain ATCC 21929 most closely resembles B. paramycoides NH24A2 T , producing ANIb and DDH values of 86.70% and 34.1%, respectively. Phenotypically, isolate ATCC 21929 does not possess cytochrome c oxidase activity, and is able to grow at a range of temperatures 15°C - 43°C and at a range of pH 6 - 9. With regards to fatty acid composition, this isolate has iso-C17:0 in highest abundance. We propose the strain ATCC 21929 T (=PS00077A T = PS00077B T = PSU-0922 T = BHP T ) as a new species named Bacillus clarus sp. nov. to facilitate accurate taxonomic classification of B. cereus group isolates.

Wastewater surveillance has emerged as a crucial public health tool for population-level pathogen surveillance. Supported by funding from the American Rescue Plan Act of 2021, the FDA's genomic epidemiology program, GenomeTrakr, was leveraged to sequence SARS-CoV-2 from wastewater sites across the United States. This initiative required the evaluation, optimization, development, and publication of new methods and analytical tools spanning sample collection through variant analyses. Version-controlled protocols for each step of the process were developed and published on protocols.io. A custom data analysis tool and a publicly accessible dashboard were built to facilitate real-time visualization of the collected data, focusing on the relative abundance of SARS-CoV-2 variants and sub-lineages across different samples and sites throughout the project. From September 2021 through June 2023, a total of 3,389 wastewater samples were collected, with 2,517 undergoing sequencing and submission to NCBI under the umbrella BioProject, PRJNA757291. Sequence data were released with explicit quality control (QC) tags on all sequence records, communicating our confidence in the quality of data. Variant analysis revealed wide circulation of Delta in the fall of 2021 and captured the sweep of Omicron and subsequent diversification of this lineage through the end of the sampling period. This project successfully achieved two important goals for the FDA's GenomeTrakr program: first, contributing timely genomic data for the SARS-CoV-2 pandemic response, and second, establishing both capacity and best practices for culture-independent, population-level environmental surveillance for other pathogens of interest to the FDA.

Abstract B. subtilis is a surface-dwelling bacterium that is competent for natural transformation. Genetically distinct B. subtilis swarms form a boundary upon encounter, mediated by a fast-evolving molecular kin discrimination (KD) system. We here demonstrate that KD-mediated swarm antagonisms in B. subtilis promote transformation-mediated horizontal gene transfer between strains of low relatedness. Gene transfer is largely uni-directional and the result of the induction of competence of the recipient strain by the donor strain is linked to a sigW-mediated stress response. More closely related strains, which in theory would experience more efficient recombination due to increased sequence homology, did not upregulate transformation upon encounter, demonstrating that social interactions can override mechanistic barriers to horizontal gene transfer. KD-mediated competence in response to the encounter of distinct neighbouring strains could maximize the probability of efficient incorporation of novel alleles and genes that have proved to function in a genomically and ecologically similar context.

Abstract The Bacillus cereus group, also known as B. cereus sensu lato ( s.l. ), is a species complex comprising numerous closely related lineages, which vary in their ability to cause illness in humans and animals. The classification of B. cereus s.l. isolates into species-level taxonomic units is essential for facilitating communication between and among microbiologists, clinicians, public health officials, and industry professionals, but is not always straightforward. A recently proposed genomospecies-subspecies-biovar taxonomic framework aims to provide a standardized nomenclature for this species complex but relies heavily on whole-genome sequencing (WGS), a technology with limited accessibility. It thus is unclear whether popular, low-cost typing methods (e.g., single- and multi-locus sequence typing) remain congruent with the proposed taxonomy. Here, we characterize 2,231 B. cereus s.l. genomes using a combination of in silico (i) average-nucleotide identity (ANI)-based genomospecies assignment, (ii) ANI-based subspecies assignment, (iii) seven-gene multi-locus sequence typing (MLST), (iv) panC group assignment, (v) rpoB allelic typing, and (vi) virulence factor detection. We show that sequence types (STs) assigned using MLST can be used for genomospecies assignment, and we provide a comprehensive list of ST/genomospecies associations. For panC group assignment, we show that an adjusted, eight-group framework is largely congruent with the proposed eight-genomospecies taxonomy and resolves incongruencies observed in the historical seven-group framework among isolates assigned to panC Groups II, III, and VI. We additionally provide a list of loci that capture the topology of the whole-genome B. cereus s.l. phylogeny that may be used in future sequence typing efforts. For researchers with access to WGS, MLST, and/or panC data, we showcase how our recently released software, BTyper3 ( https://github.com/lmc297/BTyper3 ), can be used to assign B. cereus s.l. isolates to taxonomic units within this proposed framework with little-to-no user intervention or domain-specific knowledge of B. cereus s.l. taxonomy. We additionally outline a novel method for assigning B. cereus s.l. genomes to pseudo-gene flow units within proposed genomospecies. The results presented here highlight the backwards-compatibility and accessibility of the proposed taxonomic framework and illustrate that WGS is not a necessity for microbiologists who want to use the proposed taxonomy effectively.

ABSTRACT We report the isolation and draft genome sequence of Ruoffia tabacinasalis, a novel member of the bovine nasal microbiota. The genome, which is estimated to be 90.5% complete, is composed of one contig comprising 2,363,349 bp with a GC content of 36.66%.

We isolated Salmonella enterica serovar Senftenberg in raw wastewater from 2 Pennsylvania wastewater treatment facilities during June 2022. Whole genome sequencing revealed 4 isolates separated by <4 single nucleotide polymorphisms from S. enterica Senftenberg in a cluster from the 2022 nationwide outbreak linked to contaminated peanut butter.

ABSTRACT Cytotoxic Bacillus cereus group strains are common causes of foodborne illness including diarrhea. However, our ability to assess food safety risks associated with the exposure to cytotoxic B. cereus group strains via contaminated food is limited due to the lack of predictive tools. In this study, we experimentally quantified the growth of 17 cytotoxic B. cereus group strains, representing six phylogenetic groups, in skim milk broth and used the growth data to develop an exposure assessment model. While none of the tested strains showed detectable growth in HTST milk at 4 or 6°C, 15 of the 17 strains showed growth at 10°C, 1 of the 17 strains showed growth at 8°C, and all strains grew at ≥14°C. Growth data for 16 strains allowed us to generate linear secondary growth models, which were then used to develop the exposure assessment model. We simulated a five-stage supply chain with up to 35 consumer storage days, as that was the timing when distinguishable variations in percent milk containers over 10 5 CFU/m with different B. cereus genotypes were observed. When the initial contamination level of the HTST milk is set at an average of 100 CFU/mL, the model predicts that, on consumer home storage day 21 and 35, 2.81±0.66 and 4.13±2.53 % (mean ± standard deviation) of the milk containers would exceed B. cereus group concentrations of 10 5 CFU/mL; these data represent the average across all strains. Sensitivity analysis showed that variation in the input parameter Q0, the initial physiological state of cells, has the largest effect on model’s prediction for 1 of 4 group II isolates, 1 of 6 group IV isolates and both group V isolates, suggesting the need to better characterize the growth parameters of these isolates. What-if scenario analysis showed that increased mean and variability in storage temperature at the consumer’s home both have substantial influence on final predicted B. cereus group concentration in milk containers. This model introduces an initial tool designed to facilitate risk-based food safety decision making for products that are contaminated with low B. cereus group levels.

ABSTRACT Diets rich in fruits and vegetables have been shown to exert positive effects on the gut microbiome. However, little is known about the specific effect of individual fruits or vegetables on gut microbe profiles. This study aims to elucidate the effects of tomato consumption on the gut microbiome, as tomatoes account for 22% of vegetable consumption in Western diets, and their consumption has been associated with positive health outcomes. Using piglets as a physiologically relevant model of human metabolism, 20 animals were assigned either to a control or tomato powder supplemented diet (both macronutrient matched and isocaloric) for 14 days. The microbiome was sampled rectally at three time points: day 0 (baseline), day 7 (midpoint), and at day 14 (end of study). DNA was sequenced using shotgun metagenomics, and reads were annotated using MG-RAST. There were no differences in body weight or feed intake between our two treatment groups. There was a microbial shift which included a higher ratio of Bacteroidota to Bacillota (formerly known as Bacteroidetes and Firmicutes, respectively) and higher alpha-diversity in tomato-fed animals, indicating a shift to a more desirable phenotype. Analyses at both the phyla and genera levels showed global microbiome profile changes (PERMANOVA P ≤ 0.05) over time, but not with tomato consumption. These data suggest that short-term tomato consumption can beneficially influence the gut microbial profile, warranting further investigation in humans. IMPORTANCE The composition of the microorganisms in the gut is a contributor to overall health, prompting the development of strategies to alter the microbiome composition. Studies have investigated the role of the diet on the microbiome, as it is a major modifiable risk factor contributing to health; however, little is known about the causal effects of consumption of specific foods on the gut microbiota. A more complete understanding of how individual foods impact the microbiome will enable more evidence-based dietary recommendations for long-term health. Tomatoes are of interest as the most consumed non-starchy vegetable and a common source of nutrients and phytochemicals across the world. This study aimed to elucidate the effect of short-term tomato consumption on the microbiome, using piglets as a physiologically relevant model to humans. We found that tomato consumption can positively affect the gut microbial profile, which warrants further investigation in humans.

Prophages account for a substantial part of most bacterial genomes, but the impacts on hosts remain poorly understood. Here, we combined computational and laboratory experiments to explore the abundance, distribution, and activity of prophage elements in Bacillus subtilis. NCBI database genome sequences and isolates from 1 cm3 riverbank soil samples were analyzed to provide insights at global and local geographical scales, respectively. Most prophages in wild B. subtilis isolates were related to mobile genetic elements previously identified in laboratory strains. Some large groups of prophages were closely related to completely uncharacterized yet functional Bacillus phages, or completely unknown. As certain prophage groups were unique to local isolates, we explored factors influencing prophages within a single genome. Phylogenetic relatedness was a slightly better predictor of host prophage repertoire than geographical origin. We show that cryptic phages can play a major role in acquisition and/or maintenance of other prophage elements both via strong antagonism or by co-dependence. Laboratory experiments showed that most predicted prophages may be cryptic, since they failed to induce under DNA-damaging stress conditions. Interestingly, the magnitude of stress responses remained proportional to the total number of prophage elements predicted, suggesting their importance in host physiology. This study highlights the diversity, integration patterns, and co-occurrence of prophages in B. subtilis and their potential impact on host evolution and physiology. Understanding these dynamics provides insight into bacterial genome evolution and prophage-host interactions, laying the groundwork for future experimental studies on the roles of phages in the ecology and evolution of this bacterial species.

ABSTRACT The use of water contaminated with Salmonella for produce production contributes to foodborne disease burden. To reduce human health risks, there is a need for novel, targeted approaches for assessing the pathogen status of agricultural water. We investigated the utility of water microbiome data for predicting Salmonella contamination of streams used to source water for produce production. Grab samples were collected from 60 New York streams in 2018 and tested for Salmonella . Separately, DNA was extracted from the samples and used for Illumina shotgun metagenomic sequencing. Reads were trimmed and used to assign taxonomy with Kraken2. Conditional forest (CF), regularized random forest (RRF), and support vector machine (SVM) models were implemented to predict Salmonella contamination. Model performance was determined using 10-fold cross-validation repeated 10 times to quantify area under the curve (AUC) and Kappa score. Taxa identified as the most informative for accurately predicting Salmonella contamination based on conditional variable importance were compared to taxa identified by ALDEx2 as being differentially abundant between Salmonella -positive and - negative samples. CF models outperformed the other two algorithms based on AUC (0.82 - CF, 0.76 - RRF, 0.67 - SVM) and Kappa score (0.41- CF, 0.38 - RRF, 0.19 - SVM). CF and differential abundance tests both identified Aeromonas (VI = 0.32) and Tabrizicola (VI = 0.12) as the two most informative taxa for predicting Salmonella contamination. The taxa identified in this study warrant further investigation as indicators of Salmonella contamination in Northeastern freshwater streams. IMPORTANCE Understanding the associations between surface water microbiome composition and the presence of foodborne pathogens, such as Salmonella , can facilitate the identification of novel indicators of Salmonella contamination. This study assessed the utility of microbiome data and three machine learning algorithms for predicting Salmonella contamination of Northeastern streams. The research reported here both expanded the knowledge on the microbiome composition of surface waters and identified putative novel indicators (i.e., Aeromonas and Tabrizicola ) for Salmonella in Northeastern streams. These putative indicators warrant further research to assess whether they are consistent indicators of Salmonella for regions, waterways, and years not represented in the dataset used in this study.