Following the identification of a set of hypoxia-regulated microRNAs (miRNAs), recent studies have highlighted the importance of miR-210 and of its transcriptional regulation by the transcription factor hypoxia-inducible factor-1 (HIF-1). We report here that miR-210 is overexpressed at late stages of non-small cell lung cancer. Expression of miR-210 in lung adenocarcinoma A549 cells caused an alteration of cell viability associated with induction of caspase-3/7 activity. miR-210 induced a loss of mitochondrial membrane potential and the apparition of an aberrant mitochondrial phenotype. The expression profiling of cells overexpressing miR-210 revealed a specific signature characterized by enrichment for transcripts related to 'cell death' and 'mitochondrial dysfunction', including several subunits of the electron transport chain (ETC) complexes I and II. The transcript coding for one of these ETC components, SDHD, subunit D of succinate dehydrogenase complex (SDH), was validated as a bona fide miR-210 target. Moreover, SDHD knockdown mimicked miR-210-mediated mitochondrial alterations. Finally, miR-210-dependent targeting of SDHD was able to activate HIF-1, in line with previous studies linking loss-of-function SDH mutations to HIF-1 activation. miR-210 can thus regulate mitochondrial function by targeting key ETC component genes with important consequences on cell metabolism, survival and modulation of HIF-1 activity. These observations help explain contradictory data regarding miR-210 expression and its putative function in solid tumors.

Dysregulation of vascular stiffness and cellular metabolism occurs early in pulmonary hypertension (PH). However, the mechanisms by which biophysical properties of the vascular extracellular matrix (ECM) relate to metabolic processes important in PH remain undefined. In this work, we examined cultured pulmonary vascular cells and various types of PH-diseased lung tissue and determined that ECM stiffening resulted in mechanoactivation of the transcriptional coactivators YAP and TAZ (WWTR1). YAP/TAZ activation modulated metabolic enzymes, including glutaminase (GLS1), to coordinate glutaminolysis and glycolysis. Glutaminolysis, an anaplerotic pathway, replenished aspartate for anabolic biosynthesis, which was critical for sustaining proliferation and migration within stiff ECM. In vitro, GLS1 inhibition blocked aspartate production and reprogrammed cellular proliferation pathways, while application of aspartate restored proliferation. In the monocrotaline rat model of PH, pharmacologic modulation of pulmonary vascular stiffness and YAP-dependent mechanotransduction altered glutaminolysis, pulmonary vascular proliferation, and manifestations of PH. Additionally, pharmacologic targeting of GLS1 in this model ameliorated disease progression. Notably, evaluation of simian immunodeficiency virus-infected nonhuman primates and HIV-infected subjects revealed a correlation between YAP/TAZ-GLS activation and PH. These results indicate that ECM stiffening sustains vascular cell growth and migration through YAP/TAZ-dependent glutaminolysis and anaplerosis, and thereby link mechanical stimuli to dysregulated vascular metabolism. Furthermore, this study identifies potential metabolic drug targets for therapeutic development in PH.

Carcinoma-associated fibroblasts (CAF) mediate the onset of a proinvasive tumour microenvironment. The proinflammatory cytokine LIF reprograms fibroblasts into a proinvasive phenotype, which promotes extracellular matrix remodelling and collective invasion of cancer cells. Here we unveil that exposure to LIF initiates an epigenetic switch leading to the constitutive activation of JAK1/STAT3 signalling, which results in sustained proinvasive activity of CAF. Mechanistically, p300-histone acetyltransferase acetylates STAT3, which, in turn, upregulates and activates the DNMT3b DNA methyltransferase. DNMT3b methylates CpG sites of the SHP-1 phosphatase promoter, which abrogates SHP-1 expression, and results in constitutive phosphorylation of JAK1. Sustained JAK1/STAT3 signalling is maintained by DNA methyltransferase DNMT1. Consistently, in human lung and head and neck carcinomas, STAT3 acetylation and phosphorylation are inversely correlated with SHP-1 expression. Combined inhibition of DNMT activities and JAK signalling, in vitro and in vivo, results in long-term reversion of CAF-associated proinvasive activity and restoration of the wild-type fibroblast phenotype.

Dysregulation of extracellular matrix (ECM) deposition and cellular metabolism promotes tumor aggressiveness by sustaining the activity of key growth, invasion, and survival pathways. Yet mechanisms by which biophysical properties of ECM relate to metabolic processes and tumor progression remain undefined. In both cancer cells and carcinoma-associated fibroblasts (CAFs), we found that ECM stiffening mechanoactivates glycolysis and glutamine metabolism and thus coordinates non-essential amino acid flux within the tumor niche. Specifically, we demonstrate a metabolic crosstalk between CAF and cancer cells in which CAF-derived aspartate sustains cancer cell proliferation, while cancer cell-derived glutamate balances the redox state of CAFs to promote ECM remodeling. Collectively, our findings link mechanical stimuli to dysregulated tumor metabolism and thereby highlight a new metabolic network within tumors in which diverse fuel sources are used to promote growth and aggressiveness. Furthermore, this study identifies potential metabolic drug targets for therapeutic development in cancer.

Abstract Pulmonary arterial hypertension (PAH) is a rare and fatal vascular disease with heterogeneous clinical manifestations. To date, molecular determinants underlying the development of PAH and related outcomes remain poorly understood. Herein, we identify pulmonary primary oxysterol and bile acid synthesis (PPOBAS) as a previously unrecognized pathway central to PAH pathophysiology. Mass spectrometry analysis of 2,756 individuals across five independent studies revealed 51 distinct circulating metabolites that predicted PAH-related mortality and were enriched within the PPOBAS pathway. Across independent single-center PAH studies, PPOBAS pathway metabolites were also associated with multiple cardiopulmonary measures of PAH-specific pathophysiology. Furthermore, PPOBAS metabolites were found to be increased in human and rodent PAH lung tissue and specifically produced by pulmonary endothelial cells, consistent with pulmonary origin. Finally, a poly-metabolite risk score comprising 13 PPOBAS molecules was found to not only predict PAH-related mortality but also outperform current clinical risk scores. This work identifies PPOBAS as specifically altered within PAH and establishes needed prognostic biomarkers for guiding therapy in PAH. One-Sentence Summary This work identifies pulmonary primary oxysterol and bile acid synthesis as altered in pulmonary arterial hypertension, thus establishing a new prognostic test for this disease.

Abstract To adapt in an ever-changing environment, cells must integrate physical and chemical signals and translate them into biological meaningful information through complex signaling pathways. By combining lipidomic and proteomic approaches with functional analysis, we have shown that UBTD1 (Ubiquitin domain-containing protein 1) plays a crucial role in both the EGFR (Epidermal Growth Factor Receptor) self-phosphorylation and its lysosomal degradation. On the one hand, by modulating the cellular level of ceramides through ASAH1 (N-Acylsphingosine Amidohydrolase 1) ubiquitination, UBTD1 controls the ligand-independent phosphorylation of EGFR. On the other hand, UBTD1, via the ubiquitination of SQSTM1/p62 (Sequestosome 1) and endolysosome positioning, participates in the lysosomal degradation of EGFR. The coordination of these two ubiquitin-dependent processes contributes to the control of the duration of the EGFR signal. Moreover, we showed that UBTD1 depletion exacerbates EGFR signaling and induces cell proliferation emphasizing a hitherto unknown function of UBTD1 in EGF-driven cell proliferation.

Biomolecular condensates regulate a wide range of cellular functions from signaling to RNA metabolism 1, 2 , yet, the physiologic conditions regulating their formation remain largely unexplored. Biomolecular condensate assembly is tightly regulated by the intracellular environment. Changes in the chemical or physical conditions inside cells can stimulate or inhibit condensate formation 3-5 . However, whether and how the external environment of cells can also regulate biomolecular condensation remain poorly understood. Increasing our understanding of these mechanisms is paramount as failure to control condensate formation and dynamics can lead to many diseases 6, 7 . Here, we provide evidence that matrix stiffening promotes biomolecular condensation in vivo . We demonstrate that the extracellular matrix links mechanical cues with the control of glucose metabolism to sorbitol. In turn, sorbitol acts as a natural crowding agent to promote biomolecular condensation. Using in silico simulations and in vitro assays, we establish that variations in the physiological range of sorbitol, but not glucose, concentrations, are sufficient to regulate biomolecular condensates. Accordingly, pharmacologic and genetic manipulation of intracellular sorbitol concentration modulates biomolecular condensates in breast cancer - a mechano-dependent disease. We propose that sorbitol is a mechanosensitive metabolite enabling protein condensation to control mechano-regulated cellular functions. Altogether, we uncover molecular driving forces underlying protein phase transition and provide critical insights to understand the biological function and dysfunction of protein phase separation.

Vascular inflammation critically regulates endothelial cell (EC) pathophenotypes, particularly in pulmonary arterial hypertension (PAH). Dysregulation of lysosomal activity and cholesterol metabolism have known inflammatory roles in disease, but their relevance to PAH is unclear. In human pulmonary arterial ECs and in PAH, we found that inflammatory cytokine induction of the nuclear receptor coactivator 7 (NCOA7) both preserved lysosomal acidification and served as a homeostatic brake to constrain EC immunoactivation. Conversely, NCOA7 deficiency promoted lysosomal dysfunction and proinflammatory oxysterol/bile acid generation that, in turn, contributed to EC pathophenotypes. In vivo, mice deficient for Ncoa7 or exposed to the inflammatory bile acid 7α-hydroxy-3-oxo-4-cholestenoic acid (7HOCA) displayed worsened PAH. Emphasizing this mechanism in human PAH, an unbiased, metabolome-wide association study (N=2,756) identified a plasma signature of the same NCOA7-dependent oxysterols/bile acids associated with PAH mortality (P<1.1x10-6). Supporting a genetic predisposition to NCOA7 deficiency, in genome-edited, stem cell-derived ECs, the common variant intronic SNP rs11154337 in NCOA7 regulated NCOA7 expression, lysosomal activity, oxysterol/bile acid production, and EC immunoactivation. Correspondingly, SNP rs11154337 was associated with PAH severity via six-minute walk distance and mortality in discovery (N=93, P=0.0250; HR=0.44, 95% CI [0.21-0.90]) and validation (N=630, P=2x10-4; HR=0.49, 95% CI [0.34-0.71]) cohorts. Finally, utilizing computational modeling of small molecule binding to NCOA7, we predicted and synthesized a novel activator of NCOA7 that prevented EC immunoactivation and reversed indices of rodent PAH. In summary, we have established a genetic and metabolic paradigm and a novel therapeutic agent that links lysosomal biology as well as oxysterol and bile acid processes to EC inflammation and PAH pathobiology. This paradigm carries broad implications for diagnostic and therapeutic development in PAH and in other conditions dependent upon acquired and innate immune regulation of vascular disease.

Abstract Objective Pulmonary hypertension (PH) is a cardiopulmonary disease manifesting in increased pulmonary arterial pressure and right ventricular dysfunction. PH pathogenesis involves extensive pulmonary vascular remodeling precipitated, at least in part, by endothelial reprogramming. Mounting evidence points to endothelial-to-mesenchymal transition (EndMT) as an important potentiator of endothelial reprogramming in PH, yet progress in dissecting these processes remains limited. Approach and Results Lung samples from pulmonary arterial hypertension (PAH) patients and two rodent models of PH were used. Expression of the scaffolding protein ezrin-radixin-moesin-binding phosphoprotein 50 (EBP50, or NHERF1) was downregulated in PAH patient pulmonary arteries and isolated pulmonary arterial endothelial cells (PAECs), and in PH animal lung tissue and mouse isolated PAECs. In human PAECs in vitro, EBP50 was downregulated by PH-relevant stimuli, hypoxia and proinflammatory cytokine interleukin-1 beta (IL-1β). Phenocopy of EBP50 reduction in PAECs time-dependently increased expression and nuclear abundance of EndMT transcription factors Snail and Zeb1, and potentiated hypoxia-driven upregulation of Slug. Loss of EBP50 also drove expression of mesenchymal markers S100A4, fibronectin, N-cadherin, and transgelin (SM22), and inhibited cell proliferation and barrier function. In vivo studies on female EBP50 +/- mice demonstrated that downregulation of EBP50 exacerbated the chronic hypoxia-induced rise in RV maximum pressure. Conclusions These data identify EBP50 as a key regulator of EndMT in PH whose expression is downregulated in PH patient pulmonary endothelium and whose partial deletion exacerbates PH disease manifestations in rodents, opening doors for future therapeutic strategies to target EBP50 restoration to reverse PH.

Mechanical signals regulate cell shape and influence cell metabolism and behavior. Cells withstand external forces by adjusting the stiffness of its cytoskeleton. Microtubules (MTs) act as compression-bearing elements in response to mechanical cues. Therefore, MT dynamics affect cell mechanics. Yet, how mechanical loads control MT dynamics to adjust cell mechanics to its locally constrained environment has remained unclear. Here, we show that mechanical forces rewire glutamine metabolism to promote MT glutamylation and force cell mechanics, thereby modulating mechanodependent cell functions. Pharmacologic inhibition of glutamine metabolism decreased MT glutamylation and affected their mechanical stabilization. Similarly, depletion of the tubulin glutamylase TTLL4 or overexpression of tubulin mutants lacking glutamylation site(s) increased MT dynamics, cell compliance and contractility, and thereby impacted cell spreading, proliferation and migration. Together our results indicate that mechanical cues sustain cell mechanics through glutaminolysis-dependent MT glutamylation, linking cell metabolism to MT dynamics and cell mechanics. Furthermore, our results decipher part of the enigmatic tubulin code that coordinates the fine tunable properties of MT mechanics, allowing cells to adjust the stiffness of their cytoskeleton to the mechanical loads of their environment.