Research into the aetiological agent of the most widespread form of severe malaria, Plasmodium falciparum , has benefitted enormously from the ability to culture and genetically manipulate blood-stage forms of the parasite in vitro. However, most malaria outside Africa is caused by a distinct Plasmodium species, Plasmodium vivax , and it has become increasingly apparent that zoonotic infection by the closely related simian parasite Plasmodium knowlesi is a frequent cause of life-threatening malaria in regions of southeast Asia. Neither of these important malarial species can be cultured in human cells in vitro, requiring access to primates with the associated ethical and practical constraints. We report the successful adaptation of P. knowlesi to continuous culture in human erythrocytes. Human-adapted P. knowlesi clones maintain their capacity to replicate in monkey erythrocytes and can be genetically modified with unprecedented efficiency, providing an important and unique model for studying conserved aspects of malarial biology as well as species-specific features of an emerging pathogen.

Objectives. This study examined the continuing-education needs of the currently employed public health education workforce. Methods. A national consensus panel of leading health educators from public health agencies, academic institutions, and professional organizations was convened to examine the forces creating the context for the work of public health educators and the competencies they need to practice effectively. Results. Advocacy; business management and finance; communication; community health planning and development, coalition building, and leadership; computing and technology; cultural competency; evaluation; and strategic planning were identified as areas of critical competence. Conclusions. Continuing education must strengthen a broad range of critical competencies and skills if we are to ensure the further development and effectiveness of the public health education workforce.

Abstract Plasmodium malaria parasites are obligate intracellular protozoans that use a unique form of locomotion, termed gliding motility, to move through host tissues and invade cells. The process is substrate-dependent and powered by an actomyosin motor that drives the posterior translocation of extracellular adhesins which in turn propel the parasite forward. Gliding motility is essential for tissue translocation in the sporozoite and ookinete stages; however, the short-lived erythrocyte-invading merozoite stage has never been observed to undergo gliding movement. Here we show Plasmodium merozoites possess the ability to undergo gliding motility and that this mechanism is likely an important precursor step for successful parasite invasion. We demonstrate that two human infective species, P. falciparum and P. knowlesi , have distinct merozoite motility profiles which may reflect distinct invasion strategies. Additionally, we develop and validate a higher throughput assay to evaluate the effects of genetic and pharmacological perturbations on both the molecular motor and complex signaling cascade that regulates motility in merozoites. The discovery of merozoite motility provides a new model to study the glideosome and may facilitate the pursuit of new targets for malaria treatment. Significance statement Plasmodium malaria parasites use a unique substrate-dependent locomotion termed gliding motility to translocate through tissues and invade cells. Dogma has suggested that the small labile invasive stages that invade erythrocytes, merozoites, use this motility solely to penetrate target erythrocytes. Here we reveal that merozoites use gliding motility for translocation across host cells prior to invasion. This forms an important pre-invasion step that is powered by a conserved actomyosin motor and is regulated by a complex signaling pathway. This work fundamentally changes our understanding of the role of gliding motility and invasion in the blood and will have a significant impact on our understanding of blood stage host-pathogen interactions, parasite biology, and could have implications for vaccine development.

Summary Invasion of red blood cells (RBCs) by Plasmodium merozoites is critical to their continued survival within the host. Two major protein families, the Duffy binding-like proteins (DBPs/EBAs) and the reticulocyte binding like proteins (RBLs/RHs) have been studied extensively in P. falciparum and are hypothesized to have overlapping, but critical roles just prior to host cell entry. The zoonotic malaria parasite, P. knowlesi , has larger invasive merozoites and contains a smaller, less redundant, DBP and RBL repertoire than P. falciparum . One DBP (DBPα) and one RBL, normocyte binding protein Xa (NBPXa) are essential for invasion of human RBCs. Taking advantage of the unique biological features of P. knowlesi and iterative CRISPR-Cas9 genome editing, we determine the precise order of key invasion milestones and demonstrate distinct roles for each family. These distinct roles support a mechanism for phased commitment to invasion and can be targeted synergistically with invasion inhibitory antibodies.

Abstract Recent data indicate increasing disease burden and importance of Plasmodium vivax ( Pv ) malaria. A robust assay will be essential for blood-stage Pv vaccine development. Results of the in vitro growth inhibition assay (GIA) with transgenic P. knowlesi ( Pk ) parasites expressing the Pv Duffy-binding protein region II ( Pv DBPII) correlate with in vivo protection in the first Pv DBPII controlled human malaria infection (CHMI) trials, making the Pk GIA an ideal selection tool once the precision of the assay is defined. To determine the precision in percentage of inhibition in GIA (%GIA) and in GIA 50 (antibody concentration that gave 50 %GIA), ten GIAs with transgenic Pk parasites were conducted evaluating four different anti- Pv DBPII human monoclonal antibodies (mAbs) at different concentrations, and three GIAs were conducted testing eighty anti- Pv DBPII human polyclonal antibodies (pAbs) at 10 mg/mL. A significant assay-to-assay variation was observed, and the analysis revealed a standard deviation (SD) of 13.1 in the mAb and 5.94 in the pAb dataset for %GIA, with a LogGIA 50 SD of 0.299 (for mAbs). Moreover, the ninety-five percent confidence interval (95%CI) for %GIA or GIA 50 in repeat assays was calculated in this investigation. These results will support the development of future blood-stage malaria vaccines, specifically second generation Pv DBPII-based formulations.

The efficacy of current antimalarial drugs is threatened by reduced susceptibility of Plasmodium falciparum to artemisinin. In the Mekong region this is associated with mutations in the kelch propeller-encoding domain of pfkelch13, but variants of other parasite proteins are also thought to modulate the response to drug. Evidence from human and rodent studies suggests that the mu-subunit of the AP-2 adaptin trafficking complex is one such protein of interest. We generated transgenic Plasmodium falciparum parasites encoding the I592T variant of pfap2mu, orthologous to the I568T mutation associated with in vivo artemisinin resistance in P. chabaudi. When exposed to a four-hour pulse of dihydroartemisin in the ring-stage survival assay, two P. falciparum clones expressing AP-2mu I592T displayed significant and reproducible survival of 8.0% and 10.3%, respectively, compared to <2% for the 3D7 parental line (P = 0.0011 for each clone). In immunoprecipitation and localisation studies of HA-tagged AP-2mu, we identified interacting partners including AP-2alpha, AP-1/2beta, AP-2sigma and a kelch-domain protein encoded on chromosome 10 of P. falciparum, K10. Conditional knockout indicates that the AP-2 trafficking complex in P. falciparum is essential for the fidelity of merozoite biogenesis and membrane organisation in the mature schizont. We also show that while other heterotetrameric AP-complexes and secretory factors interact with clathrin, AP-2 complex subunits do not. Thus, the AP-2 complex may be diverted from a clathrin-dependent endocytic role seen in most eukaryotes into a Plasmodium-specific function. These findings represent striking divergences from eukaryotic dogma and support a role for intracellular traffic in determining artemisinin sensitivity in vitro, confirming the existence of multiple functional routes to reduced ring-stage artemisinin susceptibility. Therefore, the utility of pfkelch13 variants as resistance markers is unlikely to be universal, and phenotypic surveillance of parasite susceptibility in vivo may be needed to identify threats to our current combination therapies.

ABSTRACT The Duffy antigen receptor for chemokines (DARC) expressed on erythrocytes is central to Plasmodium vivax (Pv) invasion of reticulocytes. Pv expresses a Duffy binding protein (PvDBP) on merozoites, a DARC ligand, and their protein-protein interaction is central to vivax blood stage malaria. Here we compared the functional activity of humAbs derived from naturally exposed and vaccinated individuals for the first time using easily cultured P. knowlesi (Pk) that had been genetically modified to replace its endogenous PkDBP orthologue with PvDBP to create a transgenic parasite, PkPvDBPOR. This transgenic parasite requires DARC to invade human erythrocytes but is not reticulocyte restricted. Using this model, we evaluated the invasion inhibition potential of 12 humAbs (9 naturally acquired; 3 vaccine-induced) targeting PvDBP individually and in combinations using growth inhibition assays (GIAs). The PvDBP-specific humAbs demonstrated 70-100% inhibition of PkPvDBPOR invasion with the IC 50 values ranging from 51 to 338 μg/mL for the 9 naturally acquired (NA) humAbs and 33 to 99 μg/ml for the 3 vaccine-induced (VI) humAbs. To evaluate antagonistic, additive, or synergistic effects, six pairwise combinations were performed using select humAbs. Of these combinations tested, one NA/NA (099100/094083) combination demonstrated relatively strong additive inhibition between 10-100 μg/mL; all combinations of NA and VI humAbs showed additive inhibition at concentrations below 25 μg/mL and antagonism at higher concentrations. None of the humAb combinations showed synergy. This PkPvDBPOR model system enables efficient assessment of NA and VI humAbs individually and in combination. IMPORTANCE Given the importance of Duffy blood group antigen and P. vivax Duffy binding protein (PvDBP) interaction leading to blood stage vivax malaria, development of vaccines or therapeutic human monoclonal antibodies (humAbs) targeting PvDBP are key strategies for treating and controlling Pv. The P. knowlesi -based PkPvDBPOR transgenic model system enables efficient assessment of NA and VI humAbs individually and in combination. As such, this model could prioritize specific humAb combinations ahead of clinical trials of these reagents.

Abstract Plasmodium knowlesi, a malaria parasite of old-world macaque monkeys, is used extensively to model Plasmodium biology. Recently P. knowlesi was found in the human population of Southeast Asia, particularly Malaysia. P. knowlesi causes un-complicated to severe and fatal malaria in the human host with features in common with the more prevalent and virulent malaria caused by Plasmodium falciparum . As such P. knowlesi presents a unique opportunity to inform an experimental model for malaria with clinical data from same-species human infections. Experimental lines of P. knowlesi represent well characterised genetically static parasites and to maximise their utility as a backdrop for understanding malaria pathophysiology, genetically diverse contemporary clinical isolates, essentially wild-type, require comparable characterization. The Oxford Nanopore PCR-free long-read sequencing platform was used to sequence P. knowlesi parasites from archived clinical samples. The sequencing platform and assembly pipeline was designed to facilitate capturing data on important multiple gene families, including the P. knowlesi schizont-infected cell agglutination ( SICA ) var genes and the Knowlesi-Interspersed Repeats ( KIR ) genes. The SICAvar and KIR gene families code for antigenically variant proteins that have been difficult to resolve and characterise. Analyses presented here suggest that the family members have arisen through a process of gene duplication, selection pressure and variation. Highly evolving genes tend to be located proximal to genetic elements that drive change rather than regions that support core gene conservation. For example, the virulence-associated P. falciparum erythrocyte membrane protein ( PfEMP1 ) gene family members are restricted to relatively unstable sub-telomeric regions. In contrast the SICAvar and KIR genes are located throughout the genome but as the study presented here shows, they occupy otherwise gene-sparse chromosomal locations. The novel methods presented here offer the malaria research community new tools to generate comprehensive genome sequence data from small clinical samples and renewed insight into these complex real-world parasites. Author summary Malaria is a potentially severe disease caused by parasite species within genus Plasmodium. Even though the number of cases is in decline there were over 200 million reported cases of malaria in 2019 that resulted in >400,000 deaths. Despite huge research efforts we still do not understand precisely how malaria makes some individuals very ill and by extension how to successfully augment and manage severe disease. Here we developed a novel method to generate comprehensive robust genome sequences from the malaria parasite Plasmodium knowlesi collected from clinical samples. We propose to use the method and initial data generated here to begin to build a resource to identify disease associated genetic traits of P. knowlesi taken from patient’s samples. In addition to the methodology, what further sets this work apart is the unique opportunity to utilize same-species experimental P. knowlesi parasites to discover a potential role for particular parasite traits in the differential disease progression we observe in patients with P. knowlesi malaria. While we developed the methods to study severe malaria, they are affordable and accessible, and offer the wider malaria research community the means to add context and insight into real-world malaria parasites.

During the course of the asexual erythrocytic stage of development, Plasmodium spp. parasites undergo a series of morphological changes and induce alterations in the host cell. At the end of this stage, the parasites exit the host cell, after which the progeny invade a new host cell. These processes are rapid and occur in a time-dependent manner. Of particular importance, egress and invasion of erythrocytes by the parasite are difficult to capture in an unsynchronized culture, or even a culture that has been synchronized to within hours. Therefore, precise synchronization of parasite cultures is of paramount importance for the investigation of these processes. Here we describe a method for synchronizing Plasmodium falciparum and Plasmodium knowlesi asexual blood stage parasites with ML10, a highly specific inhibitor of the cGMP-dependent protein kinase (PKG) that arrests parasite growth approximately 15 minutes prior to egress. This inhibitor allows parasite cultures to be synchronized to within minutes, with a simple wash step. Furthermore, we show that parasites remain viable for several hours after becoming arrested by the compound and that ML10 has advantages over the previously used PKG inhibitor Compound 2. Here, we demonstrate that ML10 is an invaluable tool for the study of Plasmodium spp. asexual blood stage biology and for the routine synchronization of P. falciparum and P. knowlesi cultures.### Competing Interest StatementThe authors have declared no competing interest.

Abstract The symptoms of malaria occur during the blood stage of infection, when the parasite replicates within human red blood cells. The human malaria parasite, Plasmodium vivax , selectively invades reticulocytes in a process which requires an interaction between the ectodomain of the human DARC receptor and the Plasmodium vivax Duffy-binding protein, PvDBP. Previous studies have revealed that a small helical peptide from DARC binds to region II of PvDBP (PvDBP-RII). However, it is also known that sulphation of tyrosine residues on DARC affects its binding to PvDBP and these residues were not observed in previous structures. We have therefore determined the structure of PvDBP-RII bound to sulphated DARC peptide, showing that a sulphate on tyrosine 41 binds to a charged pocket on PvDBP-RII. We use molecular dynamics simulations, affinity measurements and growth-inhibition experiments in parasites to confirm the importance of this interaction. We also reveal the epitope for vaccine-elicited growth-inhibitory antibody, DB1. This provides a complete understanding of the binding of PvDBP-RII to DARC and will guide the design of vaccines and therapeutics to target this essential interaction.