The skin cells of newborn mice were stably transformed in vivo with the aid of electroporation. The plasmid DNA was introduced subcutaneously followed by high-voltage pulses applied to the skin pleat. NEO-resistant colonies were found in primary cell cultures obtained from the treated skin. The experiments show that in vivo electroporation can be used for the introduction of plasmid DNA into skin cells of mouse.

MscL is multimeric protein that forms a large conductance mechanosensitive channel in the inner membrane of Escherichia coli. Since MscL is gated by tension transmitted through the lipid bilayer, we have been able to measure its gating parameters as a function of absolute tension. Using purified MscL reconstituted in liposomes, we recorded single channel currents and varied the pressure gradient (P) to vary the tension (T). The tension was calculated from P and the radius of curvature was obtained using video microscopy of the patch. The probability of being open (Po) has a steep sigmoidal dependence on T, with a midpoint (T1/2) of 11.8 dyn/cm. The maximal slope sensitivity of Po/Pc was 0.63 dyn/cm per e-fold. Assuming a Boltzmann distribution, the energy difference between the closed and fully open states in the unstressed membrane was ΔE = 18.6 kBT. If the mechanosensitivity arises from tension acting on a change of in-plane area (ΔA), the free energy, TΔA, would correspond to ΔA = 6.5 nm2. MscL is not a binary channel, but has four conducting states and a closed state. Most transition rates are independent of tension, but the rate-limiting step to opening is the transition between the closed state and the lowest conductance substate. This transition thus involves the greatest ΔA. When summed over all transitions, the in-plane area change from closed to fully open was 6 nm2, agreeing with the value obtained in the two-state analysis. Assuming a cylindrical channel, the dimensions of the (fully open) pore were comparable to ΔA. Thus, the tension dependence of channel gating is primarily one of increasing the external channel area to accommodate the pore of the smallest conducting state. The higher conducting states appear to involve conformational changes internal to the channel that don't involve changes in area.

The Landauer’s principle sets a thermodynamic bound of k B T ln 2 on the energetic cost of erasing each bit of information. It holds for any memory device, regardless of its physical implementation. It was recently shown that carefully built artificial devices can saturate this bound. In contrast, biological computation-like processes, e.g., DNA replication, transcription and translation use an order of magnitude more than their Landauer’s minimum. Here we show that saturating the Landauer bound is nevertheless possible with biological devices. This is done using a mechanosensitive channel of small conductance (MscS) from E. coli as a memory bit. MscS is a fast-acting osmolyte release valve adjusting turgor pressure inside the cell. Our patch-clamp experiments and data analysis demonstrate that under a slow switching regime, the heat dissipation in the course of tension-driven gating transitions in MscS closely approaches its Landauer’s limit. We discuss the biological implications of this physical trait.

ABSTRACT Membrane tension perceived by mechanosensitive (MS) proteins mediates cellular responses to mechanical stimuli and osmotic stresses, and it also guides multiple biological functions including cardiovascular control and development. In bacteria, MS channels function as tension-activated pores limiting excessive turgor pressure, with MscL (MS channel of large conductance) acting as an emergency release valve preventing cell lysis. Previous attempts to simulate gating transitions in MscL by either directly applying steering forces to the protein or by increasing the whole system tension were not fully successful and often disrupted the integrity of the system. We present a novel locally distributed tension molecular dynamics (LDT-MD) simulation method that allows application of forces continuously distributed among lipids surrounding the channel using a specially constructed collective variable. We report reproducible and reversible transitions of MscL to the open state with measured parameters of lateral expansion and conductivity that exactly satisfy experimental values. The LDT-MD method enables exploration of the MscL gating process with different pulling velocities and variable tension asymmetry between the inner and outer membrane leaflets. We use LDT-MD in combination with well-tempered metadynamics to reconstruct the tension-dependent free energy landscape for the opening transition in MscL. SIGNIFICANCE Membrane-embedded mechanosensitive (MS) proteins are essential for numerous biological functions including cardiovascular control and development, osmotic regulation, touch and pain sensing. In this work, we present a novel molecular dynamics simulation method that allows rapid and systematic exploration of structure, dynamics, and energetics of the mechanical transduction process in MS proteins under tightly controlled local tension distributed in the lipid rim around the protein. We provide a detailed description of the gating transition for the tension-activated bacterial mechanosensitive channel of large conductance, MscL, which is the best characterized channel of this type. MscL functions as a tension-activated emergency osmolyte release valve that limits excessive turgor pressure, prevents cell lysis and thus imparts environmental stability to most free-living bacteria.

Abstract Trypanosoma cruzi , the causative agent of Chagas disease, undergoes drastic morphological and biochemical modifications as it passes between hosts and transitions from extracellular to intracellular stages. The osmotic and mechanical aspects of these cellular transformations are not understood. Here we identify and characterize a novel mechanosensitive channel in T. cruzi (TcMscS) belonging to the superfamily of small conductance mechanosensitive channels (MscS). TcMscS is activated by membrane tension and forms a large pore permeable to anions, cations, and small osmolytes. The channel changes its location from the contractile vacuole complex in epimastigotes to the plasma membrane as the parasites develop into intracellular amastigotes. TcMscS knockout parasites show significant fitness defects, including increased cell volume, calcium dysregulation, impaired differentiation, and a dramatic decrease in infectivity. Our work provides mechanistic insights into components supporting pathogen adaptation inside the host thus opening the exploration of mechanosensation as a prerequisite of protozoan infectivity.

Adaptive desensitization and inactivation are common properties of most ion channels and receptors. The mechanosensitive channel of small conductance MscS, which serves as a low-threshold osmolyte release valve in most bacteria, is unusual because it slowly inactivates not from the open, but from the resting state under moderate tensions. The manifestation of this mechanism is the channels' ability to discriminate the rate of tension application, i.e., to ignore slow tension ramps but fully respond to abruptly applied stimuli. In this work, we present a reconstruction of the landscape for tension-dependent MscS transitions based on patch current kinetics recorded under specially designed pressure protocols. The data are analyzed with a three-state continuous time Markov model of gating, where the tension-dependent transition rates are governed by Arrhenius-type relations. The analysis provides assignments to the intrinsic opening, closing, inactivation, and recovery rates as well as their tension dependencies. These parameters, which define the spatial (areal) distances between the energy wells and the positions of barriers, describe the tension-dependent distribution of the channel population between the three states and quantitatively predict the experimentally observed dynamic pulse and ramp responses. Our solution also provides an analytic expression for the area of the inactivated state in terms of two experimentally accessible parameters: the tension at which inactivation probability is maximized, γ*, and the midpoint tension for activation, γ0.5. The analysis initially performed on Escherichia coli MscS shows its applicability to the previously uncharacterized MscS homolog from Pseudomonas aeruginosa. MscS inactivation minimizes metabolic losses during osmotic permeability response and thus contributes to the environmental fitness of bacteria.

ABSTRACT The mechanosensitive (MS) channel of large conductance, MscL, is the high-tension threshold osmolyte release valve that limits turgor pressure in bacterial cells in the event of drastic hypoosmotic shock. Despite MscL from M. tuberculosis (TbMscL) being the first structurally characterized MS channel, its protective mechanism of activation at nearly-lytic tensions has not been fully understood. Here, we describe atomistic simulations of expansion and opening of wild-type (WT) TbMscL in comparison with five of its gain-of-function (GOF) mutants. We show that under far-field membrane tension applied to the edge of the periodic simulation cell, WT TbMscL expands into a funnel-like structure with trans-membrane helices bent by nearly 70 degrees, but does not break its ‘hydrophobic seal’ within extended 20 μs simulations. GOF mutants carrying hydrophilic substitutions in the hydrophobic gate of increasing severity (A20N, V21A, V21N, V21T and V21D) also quickly transition into funnel-shaped conformations but subsequently fully open within 1-8 us. This shows that solvation of the de-wetted (vapor-locked) constriction is the rate-limiting step in the gating of TbMscL preceded by area-buffering silent expansion. Pre-solvated gates in severe V21N and V21D mutants eliminate this barrier. We predict that the asymmetric shape-change of the periplasmic side of the channel during the silent expansion provides strain-buffering to the outer leaflet thus re-distributing the tension to the inner leaflet, where the gate resides.

Intestinal bacteria, including the facultative pathogen Vibrio cholerae , can adapt to a wide range of osmotic environments. In high-osmolarity media, bacteria accumulate small compatible metabolites to maintain turgor pressure, but under drastic osmotic down-shifts bacteria are able to avoid mechanical rupture by rapidly releasing these metabolites through mechanosensitive (MS) channels. Previous experiments on V. cholerae have identified two major types of MS channels - MscS and MscL. We functionally examine these channels' specific roles in Vibrio's osmotic rescuing via genetic modification, bacterial patch-clamp electrophysiology, and stopped-flow light scattering. The light scattering kinetics revealed that WT Vibrio cells were capable of releasing up to 10% of their total non-aqueous content within ∼30 ms. To investigate each channel's individual contribution to V. cholerae's osmotic permeability response, we generated and characterized the first individual ΔmscS, ΔmscL , and double ΔmscL ΔmscS mutants in V. cholerae O395. Both mutants lacking MscS exhibited delayed osmolyte release kinetics and decreased osmotic survival rates compared to WT. Surprisingly, the ΔmscL mutant had comparable kinetics to WT, but a much higher osmotic survival, whereas Δ mscS had low survival, comparable to the double ΔmscL Δ mscS mutant. The data indicate that MscS is much more efficient in osmotic adjustment and is up-regulated in the absence of MscL, whereas in the absence of the low-threshold MscS, MscL even becomes toxic. Kinetic modeling of the cell swelling process and channel activation reveals the advantage of low-threshold MscS in curbing tension surges in Vibrio and its role in proper termination of the osmotic permeability response.