ABSTRACT Vancomycin-resistant Enterococcus faecium has become a health threat over the last 20 years due to its ability to rapidly spread and cause outbreaks in hospital settings. Although MALDI-TOF MS has already demonstrated its usefulness for accurate identification of E. faecium , its implementation for antimicrobial resistance detection is still under evaluation. The reproducibility of MALDI-TOF MS for peak analysis and its performance for correct discrimination of vancomycin susceptible isolates (VSE) from those hosting the VanA and VanB resistance mechanisms was evaluated in this study. For the first goal, intra-spot, inter-spot -technical- and inter-day -biological- reproducibility was assayed. The capability of MALDI-TOF to discriminate VSE isolates from VanA VRE and VanB VRE strains was carried out on protein spectra from 178 E. faecium unique clinical isolates −92 VSE, 31 VanA VRE, 55 VanB VRE-, processed with Clover MS Data Analysis software. Unsupervised (Principal Component Analysis –PCA-) and supervised algorithms (Support Vector Machine -SVM-, Random Forest -RF- and Partial Least Squares-Discriminant Analysis -PLS-DA-) were applied. The reproducibility assay showed lower variability for normalized data (p<0.0001) and for the peaks within the 3000-9000 m/z range. Besides, 80.9%, 79.21% and 77.53% VSE vs VRE (VanA + VanB) discrimination was achieved by applying SVM, RF and PLS-DA, respectively. Correct differentiation of VanA from VanB VRE isolates was obtained by SVM in 86.65% cases. The implementation MALDI-TOF MS and peak analysis could represent a rapid and effective tool for VRE screening. However, further improvements are needed to increase the accuracy of this approach.

Clostridioides difficile is the main cause of antibiotic related diarrhea and some ribotypes (RT), such as RT027, RT181 or RT078, are considered high risk clones. A fast and reliable approach for C. difficile ribotyping is needed for a correct clinical approach. This study analyses high-molecular-weight proteins for C. difficile ribotyping with MALDI-TOF MS. Sixty-nine isolates representative of the most common ribotypes in Europe were analyzed in the 17,000-65,000 m/z region and classified into 4 categories (RT027, RT181, RT078 and 'Other RTs'). Five supervised Machine Learning algorithms were tested for this purpose: K-Nearest Neighbors, Support Vector Machine, Partial Least Squares-Discriminant Analysis, Random Forest and Light-Gradient Boosting Machine. All algorithms yielded cross-validation results >70%, being RF and Light-GBM the best performing, with 88% of agreement. Area under the ROC curve of these two algorithms was >0.9. RT078 was correctly classified with 100% accuracy and isolates from the RT181 category could not be differentiated from RT027.

Clostridioides difficile is a major cause of hospital-acquired diarrhea, posing significant clinical challenges due to its high mortality rates and its involvement in nosocomial outbreaks. Detecting its toxigenic ribotypes (RTs) rapidly and accurately is crucial for effective management and preventing fatal outcomes. This research aimed to create a methodology based on MALDI-TOF MS and Machine Learning (ML) algorithms to differentiate C. difficile RTs. MALDI-TOF spectra were acquired from 363 clinical isolates sourcing from 10 Spanish hospitals and analysed using Clover MSDAS and AutoCdiff, an ad hoc software developed in this study. Experiments confirmed seven biomarker peaks differentiating RT027 and RT181 from other RTs. Automatic classification tools in Clover MSDAS and AutoCdiff showed up to 100% balanced accuracy, even for isolates from real-time outbreaks. The developed models, available on the AutoCdiff website -https://bacteria.id-, offer researchers a valuable tool for quick RT determination. This approach significantly reduces time, costs, and hands-on time.

ABSTRACT Mycobacterium abscessus complex is one of the most common and pathogenic nontuberculous mycobacteria (NTM) isolated in clinical laboratories. It consists of three subspecies: M. abscessus subsp. abscessus, M. abscessus subsp. bolletii and M. abscessus subsp. massiliense . Due to their different antibiotic susceptibility pattern, a rapid and accurate identification method is necessary for their differentiation. Although matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF MS) has proven useful for NTM identification, the differentiation of M. abscessus subspecies is challenging. In this study, a collection of 244 clinical isolates of M. abscessus complex was used for MALDI-TOF MS analysis and for the development of machine learning predictive models. Overall, using a Random Forest model with several confidence criteria (samples by triplicate and similarity values >60%), a total of 95.8% of isolates were correctly identified at subspecies level. In addition, differences in culture media, colony morphology and geographic origin of the strains were evaluated, showing that the latter most affected the mass spectra of isolates. Finally, after studying all protein peaks previously reported for this complex, two novel peaks with potential for subspecies differentiation were found. Therefore, machine learning methodology has proven to be a promising approach for rapid and accurate identification of subspecies of the M. abscessus complex using MALDI-TOF MS.

ABSTRACT Background Differentiation of the species within the Cryptococcus neoformans complex ( C. deneoformans, C. neoformans and C. neoformans interspecies hybrids – C. deneoformans x C. neoformans -) is important to define the epidemiology of the infection. Objectives In this study we attempted the discrimination of three C. neoformans species using MALDI-TOF MS coupled with an in-house library. Methods All Cryptococcus spp. isolates were identified by AFLP markers. An in-house database was constructed 26 well characterized C. deneoformans, C. neoformans and interspecies hybrids. Forty-four Cryptococcus spp. isolates were blindly identified using MALDI-TOF MS (Bruker Daltonics) and the expanded library. Their protein spectra were also submitted to hierarchical clustering and the resulting species were verified via Partial Least Squares Differential Analysis (PLS-DA) and Support-Vector Machine (SVM). Results MALDI-TOF MS coupled with the in-house library allowed 100% correct identification of C. deneoformans and C. neoformans but misidentified the interspecies hybrids. The same level of discrimination among C. deneoformans and C. neoformans was achieved applying SVM. The application of the PLS-DA and SVM algorithms in a two-step analysis allowed 96.95% and 96.55% correct discrimination of C. neoformans from the interspecies hybrids, respectively. Besides, PCA analysis prior to SVM provided 98.45% correct discrimination of the 3 species analysed in a one-step analysis. Conclusions Our results indicate that MALDI-TOF MS could be a rapid and reliable tool for the correct discrimination of C. deneoformans and C. neoformans . The correct identification of the interspecies hybrids could only be achieved by hierarchical clustering with other protein spectra from the same species.

ABSTRACT The Enterobacter cloacae complex (ECC) encompasses heterogeneous clusters of species that have been associated with nosocomial outbreaks. These species may host different acquired antimicrobial resistance and virulence mechanisms and their identification are challenging. This study aims to develop predictive models based on MALDI-TOF MS spectral profiles and machine learning for species-level identification. A total of 198 ECC and 116 K. aerogenes clinical isolates from the University Hospital Ramón y Cajal (Spain) and the University Hospital Basel (Switzerland) were included. The capability of the proposed method to differentiate the most common ECC species ( E. asburiae, E. kobei, E. hormaechei, E. roggenkampii, E. ludwigii, E. bugandensis ) and K. aerogenes was demonstrated by applying unsupervised hierarchical clustering with PCA pre-processing. We observed a distinctive clustering of E. hormaechei and K. aerogenes and a clear trend for the rest of the ECC species to be differentiated over the development dataset. Thus, we developed supervised, non-linear predictive models (Support Vector Machine with Radial Basis Function and Random Forest). The external validation of these models with protein spectra from the two participating hospitals yielded 100% correct species-level assignment for E. asburiae, E. kobei , and E. roggenkampii and between 91.2% and 98.0% for the remaining ECC species. Similar results were obtained with the MSI database developed recently ( https://msi.happy-dev.fr/ ) except in the case of E. hormaechei , which was more accurately identified by Random Forest. In short, MALDI-TOF MS combined with machine learning demonstrated to be a rapid and accurate method for the differentiation of ECC species.