Chromosomal rearrangements of the human MLL/KMT2A gene are associated with infant, pediatric, adult and therapy-induced acute leukemias. Here we present the data obtained from 2345 acute leukemia patients. Genomic breakpoints within the MLL gene and the involved translocation partner genes (TPGs) were determined and 11 novel TPGs were identified. Thus, a total of 135 different MLL rearrangements have been identified so far, of which 94 TPGs are now characterized at the molecular level. In all, 35 out of these 94 TPGs occur recurrently, but only 9 specific gene fusions account for more than 90% of all illegitimate recombinations of the MLL gene. We observed an age-dependent breakpoint shift with breakpoints localizing within MLL intron 11 associated with acute lymphoblastic leukemia and younger patients, while breakpoints in MLL intron 9 predominate in AML or older patients. The molecular characterization of MLL breakpoints suggests different etiologies in the different age groups and allows the correlation of functional domains of the MLL gene with clinical outcome. This study provides a comprehensive analysis of the MLL recombinome in acute leukemia and demonstrates that the establishment of patient-specific chromosomal fusion sites allows the design of specific PCR primers for minimal residual disease analyses for all patients.

Chromosomal rearrangements of the human MLL (mixed lineage leukemia) gene are associated with high-risk infant, pediatric, adult and therapy-induced acute leukemias. We used long-distance inverse-polymerase chain reaction to characterize the chromosomal rearrangement of individual acute leukemia patients. We present data of the molecular characterization of 1590 MLL-rearranged biopsy samples obtained from acute leukemia patients. The precise localization of genomic breakpoints within the MLL gene and the involved translocation partner genes (TPGs) were determined and novel TPGs identified. All patients were classified according to their gender (852 females and 745 males), age at diagnosis (558 infant, 416 pediatric and 616 adult leukemia patients) and other clinical criteria. Combined data of our study and recently published data revealed a total of 121 different MLL rearrangements, of which 79 TPGs are now characterized at the molecular level. However, only seven rearrangements seem to be predominantly associated with illegitimate recombinations of the MLL gene (∼90%): AFF1/AF4, MLLT3/AF9, MLLT1/ENL, MLLT10/AF10, ELL, partial tandem duplications (MLL PTDs) and MLLT4/AF6, respectively. The MLL breakpoint distributions for all clinical relevant subtypes (gender, disease type, age at diagnosis, reciprocal, complex and therapy-induced translocations) are presented. Finally, we present the extending network of reciprocal MLL fusions deriving from complex rearrangements.

Abstract Relapse remains a major challenge in the clinical management of acute myeloid leukemia (AML), and is driven by rare therapy-resistant leukemia-initiating stem cells (LSCs) that reside in specific bone marrow niches. Hypoxia signaling keeps cells in a quiescent and metabolically relaxed state, desensitizing them to chemotherapy. This suggests the hypothesis that hypoxia contributes to AML-LSC function and chemoresistance and is a therapeutic target to sensitize AML-LSCs to chemotherapy. Here, we provide a comprehensive single-cell expression atlas (119,000 cells) of AML cells and AML-LSCs in paired diagnostic-relapse samples from risk-stratified patients with AML. The HIF/hypoxia pathway is attenuated in AML-LSCs compared with differentiated AML cells, but is enhanced when compared with healthy hematopoietic cells. Accordingly, chemical inhibition cooperates with standard-of-care chemotherapy to impair leukemogenesis, substantially eliminating AML-LSCs. These findings support the HIF pathway as a stem cell regulator in human AML, and reveal avenues for combinatorial targeted and chemotherapy-based approaches to specifically eliminate AML-LSCs.

Long-range interactions between regulatory elements and promoters are key in gene transcriptional control; however, their study requires large amounts of starting material, which is not compatible with clinical scenarios nor the study of rare cell populations. Here we introduce low input capture Hi-C (liCHi-C) as a cost-effective, flexible method to map and robustly compare promoter interactomes at high resolution. As proof of its broad applicability, we implement liCHi-C to study normal and malignant human hematopoietic hierarchy in clinical samples. We demonstrate that the dynamic promoter architecture identifies developmental trajectories and orchestrates transcriptional transitions during cell-state commitment. Moreover, liCHi-C enables the identification of new disease-relevant cell types, genes and pathways potentially deregulated by non-coding alterations at distal regulatory elements. Finally, we show that liCHi-C can be harnessed to uncover genome-wide structural variants, resolve their breakpoints and infer their pathogenic effects. Collectively, our optimized liCHi-C method expands the study of 3D chromatin organization to unique, low-abundance cell populations, and offers an opportunity to uncover novel factors and regulatory networks involved in disease pathogenesis.

Not available.

B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL) is the most common pediatric cancer, with long-term overall survival rates of ~85%. However, B-ALL harboring rearrangements of the MLL gene (also known as KMT2A), referred to as MLLr B-ALL, is common in infants and is associated with poor 5-year survival (<30%), frequent relapses, and refractoriness to glucocorticoids (GCs). GCs are an essential part of the treatment backbone for B-ALL and GC resistance is a major clinical predictor of poor outcome. Elucidating the mechanisms of GC resistance in MLLr B-ALL is, therefore, critical to guide therapeutic strategies that deepen the response after induction therapy. Neuron-glial antigen-2 (NG2) expression is a hallmark of MLLr B-ALL and is minimally expressed in healthy hematopoietic cells. We recently reported that NG2 expression is associated with poor prognosis and that anti-NG2 immunotherapy strongly reduces/delays relapse in MLLr B-ALL xenograft models. Despite its contribution to MLLr B-ALL pathogenesis and its diagnostic utility, the role of NG2 in MLLr-mediated leukemogenesis/chemoresistance remains elusive. Here we show that NG2 is an epigenetically regulated direct target gene of the leukemic MLL-AF4 fusion protein. NG2 negatively regulates the expression of the GC receptor NR3C1 and confers GC resistance to MLLr B-ALL cells in vitro and in vivo. Mechanistically, NG2 interacts with FLT3 to render ligand-independent activation of FLT3 signaling (a hallmark of MLLr B-ALL) and downregulation of NR3C1 via AP-1-mediated trans-repression. Collectively, our study elucidates the role of NG2 in GC resistance in MLLr B-ALL through FLT3/AP-1-mediated downregulation of NR3C1, providing novel therapeutic avenues for MLLr B-ALL.

Abstract How phenotypic, clonal, and functional heterogeneity of CAR-T-cells impact clinical outcomes remain understudied. Here, we integrated clonal kinetics with transcriptomic heterogeneity resolved by single-cell omics to explore cellular dynamics response of both non-transduced (CAR neg ) and transduced (CAR pos )T-cells. CAR neg and CAR pos T-cells were longitudinally interrogated in the manufactured infusion product (IP) and in-vivo at CAR-T cell expansion peak in five B-ALL patients treated with CD19CAR-T-cells (varni-cel). Significant differences were found in the cellular dynamics between CAR pos and CAR neg T-cells in response to therapy. CAR pos T-cells in the IP exhibited a significant higher CD4:CD8 ratio than CAR neg T-cells, and the CD4:CD8 CAR pos T-cell composition impacted therapy outcome as confirmed in a larger cohort of 24 varni-cel-treated B-ALL patients. Conversely, an inverted trend in the CD4:CD8 CAR pos T-cell ratio was consistently observed at the expansion peak, with clonally expanding CD8 + effector memory and cytotoxic T-cells being the most abundant populations. Expanded cytotoxic CAR pos γδT cells emerged at the expansion peak, and the extent of their in-vivo expansion positively correlated with treatment efficacy, which was validated in a large cohort of B-ALL patients (n=18) treated with varni-cell and B-cell lymphoma patients (n=58) treated with either lisa-cel or axi-cel. Our data provide insights into the complexity and diversity of T-cell responses following CAR-T cell therapy and suggest drivers of immunotherapy response.

T cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) is an aggressive malignancy characterized by high rates of induction failure and relapse, and effective targeted immunotherapies are lacking. Despite promising clinical progress with genome-edited CD7-directed CAR-T cells, which present significant logistical and regulatory issues, CAR-T cell therapy in T-ALL remains challenging due to the shared antigen expression between malignant and healthy T cells. This can result in CAR-T cell fratricide, T cell aplasia, and the potential for blast contamination during CAR-T cell manufacturing. Recently, CAR-T cells have been described that target non-pan-T antigens, absent on healthy T cells but expressed on specific T-ALL subsets. These antigens include CD1a ( NCT05679895 ), which is expressed in cortical T-ALL, and CCR9. We show that CCR9 is expressed on >70% of T-ALL patients (132/180) and is maintained at relapse, with a safe expression profile in healthy hematopoietic and non-hematopoietic tissues. Further analyses showed that dual targeting of CCR9 and CD1a could benefit ~86% of patients with T-ALL, with a greater blast coverage than single CAR-T cell treatments. We therefore developed, characterized, and preclinically validated a novel humanized CCR9-specific CAR with robust and specific antileukemic activity as a monotherapy in vitro and in vivo against cell lines, primary T-ALL samples, and patient-derived xenografts. Importantly, CCR9/CD1a dual-targeting CAR-T cells showed higher efficacy than single-targeting CAR-T cells, particularly in T-ALL cases with phenotypically heterogeneous leukemic populations. Dual CCR9/CD1a CAR-T therapy may prevent T cell aplasia and obviate the need for allogeneic transplantation and regulatory-challenging genome engineering approaches in T-ALL.

Summary Maintenance of pluripotency is a multifactorial process in which NF-κB is a negative regulator. Our previous work identified a chromatin role for IκBα, the master regulator of NF-κB signaling, that is critical for the proper regulation of various tissue stem cells. Here, we found that IκBα accumulates specifically in the chromatin fraction of pluripotent embryonic stem cells. IκBα depletion does not affect NF-kB-dependent transcription, but causes a profound epigenetic rewiring in pluripotent stem cells, including alterations in H3K27me3, a histone mark catalyzed by Polycomb repression complex 2. Chromatin changes induced by IκBα depletion affect a subset of pluripotency genes and are associated with altered gene transcription. At the cellular level, IκBα-deficient embryonic stem cells are arrested in a naive pluripotency state when cultured in serum/LIF conditions and fail to exit pluripotency under differentiation conditions. By constructing separation-of-function mutants, we show that the effects of IκBα in regulating stem cell pluripotency are NF-κB-independent, but mainly rely on its chromatin-related function. Taken together, our results reveal a novel mechanism by which IκBα participates in the regulation of the pluripotent state of embryonic stem cells and shed light on the interplay between inflammatory signals and the regulation of pluripotency.

2550 Background: Antigen-specific cancer immunotherapies, based on engineered T cells bearing chimeric antigen receptors (CARs) or the systemic administration of bispecific T cell-engagers (TCEs), have a significant impact on relapsed/refractory (R/R) B cell malignancies. However, a significant percentage of patients relapse following CAR-T or TCE therapy, with antigen loss accounting for up to one third of relapses/progressions. To avoid antigen loss after administration of single-targeted CAR-T cells and to minimize tumor escape, strategies targeting two antigens simultaneously have been developed and validated in both preclinical models and clinical trials. Nevertheless, despite lowering the risk of antigen loss, these strategies still have some limitations, mainly related to design and manufacturing challenges. Methods: In this context, we have generated the first dual-target strategy for hematological malignancies based on T cells bearing an anti-CD22 CAR and secreting an anti-CD19 T-cell engager antibody (CAR-STAb-T cells) and conducted a comprehensive preclinical study comparing its therapeutic potential with a previously validated anti-CD19/CD22 tandem CAR therapy (TanCAR-T) for B-cell acute lymphoblastic leukemia (B-ALL). Results: We have demonstrated in both short- and long-term assays, using contact and non-contact co-culture systems, that CAR-STAb-T cells efficiently redirect bystander T cells, resulting in enhanced cytotoxic activity compared to that exhibited by TanCAR-T cells at very low E:T ratios. In addition, CAR-STAb-T cells induce more potent and faster cytotoxic responses than TanCAR-T cells in both short- and long-term co-culture assays when reproducing antigen-downmodulated conditions in vitro. In vivo assays conducted in NSG mice transplanted with a B-ALL patient-derived xenograft (PDX), followed by intravenous injection of CAR-STAb-T or TanCAR-T cells under a T cell-limiting experimental setting, also showed that CAR-STAb-T cells maintained a tighter control of tumor progression than TanCAR-T cells in peripheral blood and bone marrow. Conclusions: In conclusion, we have demonstrated that the combination of a cell surface CAR and a soluble TCE recognizing different antigens may be advantageous over the use of conventional multi-targeted strategies based on cell surface-anchored receptors. Furthermore, we have proven that a small number of transduced CAR-STAb-T cells is sufficient to redirect non-transduced bystander T cells specifically and efficiently in the presence of leukemia cells, providing a significant advantage over current dual-targeted CAR-T cell therapies. CAR-STAb-T cells could therefore become an alternative to CAR-T therapies for the treatment of R/R B cell malignancies, especially in lymphodepleted patients with low T cell counts.