Abstract Severe acute respiratory syndrome coronavirus 2 (SARS-CoV-2) is still adapting to its new human host. Attention has focussed on the viral spike protein, but substantial variation has been seen in the ORF8 gene. Here, we show that SARS-CoV-2 ORF8 protein undergoes signal peptide-mediated processing through the endoplasmic reticulum and is secreted as a glycosylated, disulphide-linked dimer. The secreted protein from the prototype SARS-CoV-2 virus had no major effect on viability of a variety of cell types, or on IFN or NF-κB signalling. However, it modulated cytokine expression from primary CSF1-derived human macrophages, most notably by decreasing IL-6 and IL-8 secretion. Furthermore, a sequence polymorphism L84S that appeared early in the pandemic associated with the Clade S lineage of virus, showed a markedly different effect, of increasing IL-6 production. We conclude that ORF8 sequence polymorphisms can potentially affect SARS-CoV-2 virulence and should therefore be monitored in sequencing-based surveillance.

Glucocorticoids modulate glucose homeostasis, acting on metabolically active tissues such as liver, skeletal muscle, and adipose tissue. Intracellular regulation of glucocorticoid action in adipose tissue impacts metabolic responses to obesity. ATP-binding cassette family C member 1 (ABCC1) is a transmembrane glucocorticoid transporter known to limit the accumulation of exogenously administered corticosterone in adipose tissue. However, the role of ABCC1 in the regulation of endogenous glucocorticoid action and its impact on fuel metabolism has not been studied. Here, we investigate the impact of Abcc1 deficiency on glucocorticoid action and high-fat-diet (HFD)-induced obesity. In lean male mice, deficiency of Abcc1 increased endogenous corticosterone levels in skeletal muscle and adipose tissue but did not impact insulin sensitivity. In contrast, Abcc1 -deficient male mice on HFD displayed impaired glucose and insulin tolerance, and fasting hyperinsulinaemia, without alterations in tissue corticosterone levels. Proteomics and bulk RNA sequencing revealed that Abcc1 deficiency amplified the transcriptional response to an obesogenic diet in adipose tissue but not in skeletal muscle. Moreover, Abcc1 deficiency impairs key signalling pathways related to glucose metabolism in both skeletal muscle and adipose tissue, in particular those related to OXPHOS machinery and Glut4. Together, our results highlight a role for ABCC1 in regulating glucose homeostasis, demonstrating diet-dependent effects that are not associated with altered tissue glucocorticoid concentrations.

ABSTRACT CpG dinucleotides are under-represented in the genomes of most RNA viruses. Synonymously increasing CpG content of a range of RNA viruses reliably causes replication defects due to the recognition of CpG motifs in RNA by cellular Zinc-finger Antiviral Protein (ZAP). Prior to the discovery of ZAP as a CpG sensor, we described an engineered influenza A virus (IAV) enriched for CpGs in segment 5 that displays the expected replication defects. However, we report here that this CpG-high (‘CpGH’) mutant is not attenuated by ZAP. To understand this, we sought to uncover the alternative attenuation mechanism(s). IAV segment 5 encodes NP, a component of the viral RNA replication complex. Unexpectedly, while CpG enrichment resulted in depleted segment 5 transcript and NP protein abundance, this did not impair viral polymerase activity. A pair of nucleotide changes, introduced as compensatory changes to maintain base frequencies, were instead found to be responsible for the replication defect. These mutations resulted in the encoding of a stretch of eight consecutive adenosines (8A), a phenomenon not seen in natural IAV isolates. Sequencing experiments revealed evidence of viral polymerase slippage at this site, resulting in the production of aberrant peptides and type I interferon induction. When the nucleotides in either of these two positions were restored to wildtype sequence, no viral attenuation was seen, despite the 86 extra CpGs encoded by this virus. Conversely, when these two adenosines were introduced into wildtype virus (thereby introducing the 8A tract), viral attenuation, polymerase slippage, aberrant peptide production and type I interferon induction were apparent. That a single nucleotide change can offset the growth defects in a virus designed to have a formidable barrier to wild-type reversion highlights the importance of understanding the processes underlying viral attenuation. The lessons from this study will inform improved recoding designs in the future.

Objective: The multifunctional NS1 protein of influenza A virus has roles in antagonising cellular innate immune responses and promoting viral gene expression. To better understand the interplay between these functions, we tested the effects of NS1 effector domain mutations known to affect homo-dimerisation or interactions with cellular PI3 kinase or Trim25 on NS1 ability to promote nuclear export of viral mRNAs. Results: The NS1 dimerisation mutant W187R retained the functions of binding cellular NXF1 as well as stabilising NXF1 interaction with viral segment 7 mRNAs and promoting their nuclear export. Two PI3K-binding mutants, NS1 Y89F and Y89A still bound NXF1 but no longer promoted NXF1 interactions with segment 7 mRNA or its nuclear export. The Trim25-binding mutant NS1 E96A/E97A bound NXF1 and supported NXF1 interactions with segment 7 mRNA but no longer supported mRNA nuclear export. Analysis of WT and mutant NS1 interaction partners identified hsp70 as specifically binding to NS1 E96A/E97A. Whilst these data suggest the possibility of functional links between NS1 effects on intracellular signalling and its role in viral mRNA nuclear export, they also indicate potential pleiotropic effects of the NS1 mutations; in the case of E96A/E97A possibly via disrupted protein folding leading to chaperone recruitment.

Hepatocyte transplantation has shown promise for genetic diseases of the hepatocytes but to date has shown limited efficacy for non-genetic forms of severe liver injury. Limited cell engraftment and poor function of donor hepatocytes in recipient livers impacts the clinical utility of hepatocyte cell therapy. The mechanisms underpinning this are poorly understood. We explored this in a liver injury model, where predictable levels of injury and hepatocyte senescence was induced in AhCreMdm2

A state-of-the-art multi-omics approach was applied to improve our understanding of the aetio-pathogenesis of a highly prevalent, performance-limiting disorder of racehorses: mild-to-moderate equine asthma (MMEA). This is a prerequisite to improving prophylactic, management, and therapeutic options for this condition. Although a number of risk factors have been identified, options for intervention are limited. This study applied a multi-omic approach to reveal key inflammatory pathways involved in inflammatory cell recruitment to the lower airways and highlight distinct MMEA inflammatory profiles. We compared bronchoalveolar lavage fluid (BALF) cell gene and protein expression data from horses with non-inflammatory BALF cytology with those isolated from horses with neutrophilic, mastocytic, mixed neutrophilic/mastocytic, and eosinophilic/mastocytic inflammation. The analyses on transcriptomic/proteomic data derived from BALF from horses with neutrophilic cytology showed enrichment in classical inflammatory pathways, and horses with mastocytic inflammation showed enrichment in pathways involved in hypersensitivity reactions related to nonclassical inflammation potentially mimicking a Th2-immune response. The mixed eosinophilic/mastocytic group also presented with a nonclassical inflammatory profile, whereas the mixed neutrophilic/mastocytic group revealed profiles consistent with both neutrophilic inflammation and hypersensitivity. Our adopted multi-omics approach provided a holistic assessment of the immunological status of the lower airways associated with the different cytological profiles of equine asthma.

Glucocorticoids modulate glucose homeostasis, acting on metabolically active tissues such as liver, skeletal muscle, and adipose tissue. Intra-cellular regulation of glucocorticoid action in adipose tissue impacts metabolic responses to obesity. ATP-Binding Cassette Family C member 1 (ABCC1) is a transmembrane glucocorticoid transporter known to limit the accumulation of exogenously administered corticosterone in adipose tissue. However, the role of ABCC1 in the regulation of endogenous glucocorticoid action and its impact on fuel metabolism has not been studied. Here, we investigate the impact of Abcc1 deficiency on glucocorticoid action and high fat-diet (HFD)-induced obesity. In lean mice, deficiency of Abcc1 increased endogenous corticosterone levels in skeletal muscle and adipose tissue but did not impact insulin sensitivity. In contrast, Abcc1-deficient mice on HFD displayed impaired glucose and insulin tolerance, and fasting hyperinsulinemia, without alterations in tissue corticosterone levels. Proteomics and bulk RNA sequencing in adipose tissue and skeletal muscle revealed that Abcc1 deficiency amplified the transcriptional response to an obesogenic diet in adipose tissue. Moreover, the Abcc1 deficiency impairs key signalling pathways related to glucose metabolism in both skeletal muscle and adipose tissue, in particular those related to OXPHOS machinery and Glut4. Together, our results highlight a role for ABCC1 in regulating glucose homeostasis, demonstrating diet-dependent effects that are not associated with altered tissue glucocorticoid concentrations.