Summary Type VII secretion (T7S) systems, also referred to as ESAT6 secretion (ESX) systems, are molecular machines that have gained great attention due to their implication in cell homeostasis and host pathogen interactions in mycobacteria. The latter include important human pathogens such as Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the etiological cause of human tuberculosis and a pandemic accounting for more than 1 million deaths every year. The ESX5 system is exclusively found in slow-growing pathogenic mycobacteria, where it mediates the secretion of a large family of virulence factors, the PE and PPE proteins. The secretion driving force is provided by EccC 5 , a multidomain ATPase operating through four globular cytosolic domains, an N-terminal domain of unknown function (EccC DUF ) and three FtsK/SpoIIIE ATPase domains. Recent structural and functional studies of ESX3 and ESX5 systems have revealed EccC DUF as an ATPase-like fold domain with potential ATPase activity, and whose functionality is essential for secretion. Here we report the crystal structure of Mtb EccC 5 DUF domain at 2.05 Å resolution, which unveils a nucleotide-free structure with degenerated cis -acting and trans -acting elements involved in ATP-binding and hydrolysis. Our crystallographic study, together with a biophysical assessment of Mtb EccC 5 DUF interaction with ATP/Mg 2+ , supports the absence of ATPase activity proposed for this domain. We show that this degeneration is also present in DUF domains of other ESX and ESX-like systems, which are likely to exhibit poor or null ATPase activity. Moreover, and based on an in-silico model of Mtb EccC 5 N-terminal region, we propose that Mtb EccC 5 DUF is a degenerated ATPase domain that may have retained the ability to hexamerise. Observations that call the attention on DUF domains as structural elements with potential implications in the opening and closure of the membrane pore during the secretion process.

Type VII secretion (T7S) systems, also referred to as ESAT-6 secretion (ESX) systems, are molecular machines that have gained great attention due to their implications in cell homeostasis and in host–pathogen interactions in mycobacteria. The latter include important human pathogens such as Mycobacterium tuberculosis ( Mtb ), the etiological cause of human tuberculosis, which constitutes a pandemic accounting for more than one million deaths every year. The ESX-5 system is exclusively found in slow-growing pathogenic mycobacteria, where it mediates the secretion of a large family of virulence factors: the PE and PPE proteins. The secretion driving force is provided by EccC 5 , a multidomain ATPase that operates using four globular cytosolic domains: an N-terminal domain of unknown function (EccC 5 DUF ) and three FtsK/SpoIIIE ATPase domains. Recent structural and functional studies of ESX-3 and ESX-5 systems have revealed EccC DUF to be an ATPase-like fold domain with potential ATPase activity, the functionality of which is essential for secretion. Here, the crystal structure of the Mtb EccC 5 DUF domain is reported at 2.05 Å resolution, which reveals a nucleotide-free structure with degenerated cis -acting and trans -acting elements involved in ATP binding and hydrolysis. This crystallographic study, together with a biophysical assessment of the interaction of Mtb EccC 5 DUF with ATP/Mg 2+ , supports the absence of ATPase activity proposed for this domain. It is shown that this degeneration is also present in DUF domains from other ESX and ESX-like systems, which are likely to exhibit poor or null ATPase activity. Moreover, based on an in silico model of the N-terminal region of Mtb EccC 5 DUF , it is hypothesized that Mtb EccC 5 DUF is a degenerated ATPase domain that may have retained the ability to hexamerize. These observations draw attention to DUF domains as structural elements with potential implications in the opening and closure of the membrane pore during the secretion process via their involvement in inter-protomer interactions.

Mycobacteria embrace a broad pool of microorganisms causing infections with renowned impact in human health causing altogether millions of deaths every year. From tuberculosis and lepra, caused by Mycobacterium tuberculosis and Mycobacterium leprae respectively, to infections caused by emergent/opportunistic pathogens such as Mycobacterium abscessus. The battle to confront this health burden is further challenged by limitations in the treatments currently available and the emergence of antimicrobial resistance, thus making necessary the search for new therapeutic strategies to fight these infections. Mycobacteriophage LysA endolysins are complex multi-domain peptidoglycan hydrolyses with reported antimicrobial relevance and potential to treat mycobacterial infections. However, and despite the therapeutic prospective of LysAs, a profound understanding of their mechanism of action still remains limited. The present work provides a thorough structural-functional study of the catalytic domains of two LysA endolysins encoded by the bacteriophages D29 and DS6A, known to infect pathogenic mycobacteria including M. tuberculosis. As part of this study, we have characterised the four catalytic domains bared by both endolysins (D29N4/D29GH19 and DS6AGH19/DS6AAmi2B) alone and in complex with PG analogues. To do so, our approach was to combine protein engineering, X-ray crystallography, small-angle X-ray scattering and in silico tools that, to our knowledge, it has yielded the first experimental structures reported for mycobacteriophage endolysins. Our study unravels major aspects of peptidoglycan-binding and hydrolysis by D29LysA and DS6ALysA lysins and other homologue LysAs, including the hydrolase domains alike to the ones here examined. Altogether, this constitutes an important step forward for understanding how the mycobacterial cell-wall hydrolysis is done by this relevant class of endolysins and, opening the path for their future use in their therapeutic exploration as enzybiotics, allowing the rational design of a la carte enzymes with optimised lytic properties against mycobacterial pathogens.