Abstract A GGGGCC repeat expansion in C9orf72 is the most common genetic cause of ALS and FTD (C9ALS/FTD). The presence of dipeptide repeat (DPR) proteins, generated by translation of the expanded repeat, is a major pathogenic feature of C9ALS/FTD pathology, but their most relevant effects in a physiological context are not known. Here, we generated C9orf72 DPR knock-in mouse models characterised by physiological expression of 400 codon-optimised polyGR or polyPR repeats, and heterozygous C9orf72 reduction. (GR)400 and (PR)400 knock-in mice exhibit cortical neuronal hyperexcitability, age-dependent spinal motor neuron loss and progressive motor dysfunction, showing that they recapitulate key features of C9FTD/ALS. Quantitative proteomics revealed an increase in extracellular matrix (ECM) proteins in (GR)400 and (PR)400 spinal cord, with the collagen COL6A1 the most increased protein. This signature of increased ECM proteins was also present in C9ALS patient iPSC-motor neurons indicating it is a conserved feature of C9ALS/FTD. TGF-β1 was one of the top predicted regulators of this ECM signature and polyGR expression in human iPSC-neurons was sufficient to induce TGF-β1 followed by COL6A1, indicating TGF-β1 is one driver of the ECM signature. Knockdown of the TGF-β1 or COL6A1 orthologue in Drosophila dramatically and specifically exacerbated neurodegeneration in polyGR flies, showing that TGF-β1 and COL6A1 protect against polyGR toxicity. Altogether, our physiological C9orf72 DPR knock-in mice have revealed a neuroprotective and conserved ECM signature in C9FTD/ALS.

Abstract The most common genetic cause of both frontotemporal dementia (FTD) and amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a G 4 C 2 repeat expansion in intron 1 of the C9orf72 gene. This repeat expansion undergoes bidirectional transcription to produce sense and antisense repeat RNA species. Both sense and antisense-derived repeat RNAs undergo repeat-associated non-AUG translation in all reading frames to generate five distinct dipeptide repeat proteins (DPRs). Importantly, toxicity has been associated with both sense and antisense repeat-derived RNA and DPRs. This suggests targeting both sense and antisense repeat RNA may provide the most effective therapeutic strategy. The RNA-targeting CRISPR-Cas13 systems offer a promising avenue for simultaneous targeting of multiple RNA transcripts, as they mature their own guide arrays, thus allowing targeting of more than one RNA species from a single construct. We show that CRISPR-Cas13d originating from Ruminococcus flavefaciens (CasRx) can successfully reduce C9orf72 sense and antisense repeat transcripts and DPRs to background levels in HEK cells overexpressing C9orf72 repeats. CRISPR-CasRx also markedly reduced the endogenous sense and antisense repeat RNAs and DPRs in three independent C9orf72 patient-derived iPSC-neuron lines, without detectable off-target effects. To determine whether CRISPR-CasRx is effective in vivo , we treated two distinct C9orf72 repeat mouse models using AAV delivery and observed a significant reduction in both sense and antisense repeat-containing transcripts. Taken together this work highlights the potential for RNA-targeting CRISPR systems as therapeutics for C9orf72 ALS/FTD.