ABSTRACT The balance between self-renewal and differentiation in human fetal lung epithelial progenitors controls the size and function of the adult organ. Moreover, progenitor cell gene regulation networks are employed by both regenerating and malignant lung cells, where modulators of their effects could potentially be of therapeutic value. Details of the molecular networks controlling human lung progenitor self-renewal remain unknown. We performed the first CRISPRi screen in primary human lung organoids to identify transcription factors controlling progenitor self-renewal. We show that SOX9 promotes proliferation of lung progenitors and inhibits precocious airway differentiation. Moreover, by identifying direct transcriptional targets using Targeted DamID we place SOX9 at the centre of a transcriptional network which amplifies WNT and RTK signalling to stabilise the progenitor cell state. In addition, the proof-of-principle CRISPRi screen and Targeted DamID tools establish a new approach for using primary human organoids to elucidate detailed functional mechanisms underlying normal development and disease. Highlights A pooled CRISPRi screen in human fetal lung organoids identified transcription factors controlling progenitor cell self-renewal. SOX9 promotes tip progenitor cell proliferation and supresses precocious airway differentiation. Targeted DamID (TaDa) identified SOX9 direct binding targets, revealing that SOX9 lies at the intersection of WNT and RTK signalling. SOX9 and ETVs co-regulate the human fetal lung progenitor self-renewal programme.

ABSTRACT The 10x Genomics Gene Expression Flex protocol allows profiling of fixed or frozen material, greatly simplifying the logistics of sample collection, storage and transfer prior to single -cell sequencing. The method makes single-cell transcriptomics possible for existing fresh-frozen or FFPE tissue samples, but also facilitates the logistics of the sampling process, allowing instant preservation of samples. The technology relies on species-specific probes available for human and mouse. Nevertheless, processing of patient-derived (PDX) or cell line (CDX) xenografts, which contain mixed human and mouse cells, is currently not supported by this protocol due to the high degree of homology between the probe sets. Here we show that it is feasible to simultaneously profile populations containing both human and mouse cells by mixing the transcriptome probe sets of both species. Cellranger outputs a count table for each of the species allowing evaluation of the performance of the different probe sets. Cross-reactive probes are greatly outperformed by the specific probe hybridizations leading to a clear difference in the recovery of UMIs and unique genes per cell. Furthermore, we developed a pipeline that removes cross-reactive signal from the data and provides species-specific count tables for further downstream analysis. Hence, the 10x Genomics Gene Expression Flex protocol can be used to process xenograft samples without the need for separation of human and mouse cells by flow sorting and allows analysis of the human and mouse single-cell transcriptome from each sample. We anticipate it will be increasingly used for single-cell sequencing of cancer cell line and patient-derived xenografts, facilitating the preservation of the samples and allowing the interrogation of both the (human) xenograft and the (mouse) tumor microenvironment at single-cell resolution.

Abstract Histone modifications play a key role in regulating gene expression and cell fate during development and disease. Current methods for cell-type specific genome-wide profiling of histone modifications require dissociation and isolation of cells and are not compatible with all tissue types. Here we adapt Targeted DamID to recognise specific histone marks, by fusing chromatin binding proteins or single-chain antibodies to Dam, an E. coli DNA adenine methylase. When combined with Targeted DamID (TaDa), this enables cell-type specific chromatin profiling in intact tissues or organisms. We first profiled H3K4me3, H3K9ac, H3K27me3 and H4K20me1 in vivo in neural stem cells of the developing Drosophila brain. Next, we mapped cell-type specific H3K4me3 distribution in neural stem cells of the developing mouse brain. Finally, we injected RNA encoding DamID constructs into 1-cell stage Xenopus embryos to profile H3K4me3 distribution during gastrulation and neurulation. These results illustrate the versatility of Targeted DamID to profile cell-type specific histone marks throughout the genome in diverse model systems. Summary statement Targeted DamID enables genome-wide cell-type specific detection of histone modifications in vivo in Drosophila , mouse and Xenopus .