Abstract Sequence-based genetic testing identifies causative variants in ~ 50% of individuals with developmental and epileptic encephalopathies (DEEs). Aberrant changes in DNA methylation are implicated in various neurodevelopmental disorders but remain unstudied in DEEs. We interrogate the diagnostic utility of genome-wide DNA methylation array analysis on peripheral blood samples from 582 individuals with genetically unsolved DEEs. We identify rare differentially methylated regions (DMRs) and explanatory episignatures to uncover causative and candidate genetic etiologies in 12 individuals. Using long-read sequencing, we identify DNA variants underlying rare DMRs, including one balanced translocation, three CG-rich repeat expansions, and four copy number variants. We also identify pathogenic variants associated with episignatures. Finally, we refine the CHD2 episignature using an 850 K methylation array and bisulfite sequencing to investigate potential insights into CHD2 pathophysiology. Our study demonstrates the diagnostic yield of genome-wide DNA methylation analysis to identify causal and candidate variants as 2% (12/582) for unsolved DEE cases.

SPTLC1 encodes a critical subunit of serine palmitoyltransferase, the enzyme catalyzing the first and rate-limiting step in de novo sphingolipid biosynthesis, and mutations in this gene are known to cause hereditary sensory autonomic neuropathy, type 1A . Using exome sequencing, we identified a de novo variant in SPTLC1 resulting in a p.Ala20Ser amino acid change in an individual diagnosed with juvenile-onset amyotrophic lateral sclerosis (ALS) and confirmed its pathogenicity by showing elevated plasma levels of neurotoxic deoxymethyl-sphinganine. A second case of juvenile-onset ALS arising again from a p.Ala20Ser mutation was later identified, confirming the association of SPTLC1 with this form of motor neuron disease. We also found SPTLC1 mutations in 0.34% of 5,607 ALS cases, and immunohistochemically confirmed the expression of SPTLC1 in spinal cord motor neurons, supporting their role in the pathogenesis of this fatal neurological disease. We corrected the toxicity of deoxymethyl-sphinganine in HEK293FT cells using L-serine supplementation. Our data broaden the phenotype associated with SPTLC1 and suggest that nutritional supplementation with serine may be beneficial if instituted at an early stage among patients carrying mutations in SPTLC1 .

ABSTRACT BACKGROUND Despite widespread availability of clinical genetic testing, many individuals with suspected genetic conditions do not have a precise diagnosis. This limits their opportunity to take advantage of state-of-the-art treatments. In such instances, testing sometimes reveals difficult-to-evaluate complex structural differences, candidate variants that do not fully explain the phenotype, single pathogenic variants in recessive disorders, or no variants in specific genes of interest. Thus, there is a need for better tools to identify a precise genetic diagnosis in individuals when conventional testing approaches have been exhausted. METHODS Targeted long-read sequencing (T-LRS) was performed on 33 individuals using Read Until on the Oxford Nanopore platform. This method allowed us to computationally target up to 100 Mbp of sequence per experiment, resulting in an average of 20x coverage of target regions, a 500% increase over background. We analyzed patient DNA for pathogenic substitutions, structural variants, and methylation differences using a single data source. RESULTS The effectiveness of T-LRS was validated by detecting all genomic aberrations, including single-nucleotide variants, copy number changes, repeat expansions, and methylation differences, previously identified by prior clinical testing. In 6/7 individuals who had complex structural rearrangements, T-LRS enabled more precise resolution of the mutation, which led, in one case, to a change in clinical management. In nine individuals with suspected Mendelian conditions who lacked a precise genetic diagnosis, T-LRS identified pathogenic or likely pathogenic variants in five and variants of uncertain significance in two others. CONCLUSIONS T-LRS can accurately predict pathogenic copy number variants and triplet repeat expansions, resolve complex rearrangements, and identify single-nucleotide variants not detected by other technologies, including short-read sequencing. T-LRS represents an efficient and cost-effective strategy to evaluate high-priority candidate genes and regions or to further evaluate complex clinical testing results. The application of T-LRS will likely increase the diagnostic rate of rare disorders.

UBA5 encodes for the E1 enzyme of the UFMylation cascade, which plays an essential role in ER homeostasis. The clinical phenotypes of UBA5-associated encephalopathy include developmental delays, epilepsy and intellectual disability. To date, there is no humanized neuronal model to study the cellular and molecular consequences of UBA5 pathogenic variants. We developed and characterized patient-derived cortical organoid cultures and identified defects in GABAergic interneuron development. We demonstrated aberrant neuronal firing and microcephaly phenotypes in patient-derived organoids. Mechanistically, we show that ER homeostasis is perturbed along with exacerbated unfolded protein response pathway in cells and organoids expressing UBA5 pathogenic variants. We also assessed two gene expression modalities that augmented UBA5 expression to rescue aberrant molecular and cellular phenotypes. Our study provides a novel humanized model that allows further investigations of UBA5 variants in the brain and highlights novel systemic approaches to alleviate cellular aberrations for this rare, developmental disorder.

PURPOSE The use of up-front tumor genomic sequencing (TGS) is becoming increasingly common in pediatric oncology. Despite this, little is known about how parents receive information about TGS at the time of their child's cancer diagnosis. We aimed to describe parents' experiences with and preferences for receiving information about TGS and to use these findings to inform practical guidance for pediatric oncology clinicians. METHODS We conducted semistructured interviews with English-speaking parents (older than 18 years) of patients (younger than 18 years) who had TGS for a new diagnosis of cancer. We analyzed the interviews thematically. Participants also completed a short demographic survey, and we obtained medical information about participants' children via chart review. RESULTS We interviewed 20 parents (14 mothers; median age, 38 years) of children who underwent TGS for a newly diagnosed cancer (10 leukemias/lymphomas, three CNS tumors, seven other solid tumors). Children were 6 months to 17 years at diagnosis (median, 6 years). Fifteen parents and their children were White, two of whom were Hispanic and four of whose children were Hispanic. No participants identified themselves or their child as Black. We identified the following themes regarding information delivery about genomic testing from the interviews: (1) those in the parent role have some universal information needs; (2) information delivery preferences vary among parents, even within one family; and (3) parents desire standard yet tailored information delivery. CONCLUSION Parents made suggestions consistent with elements of established high-quality communication in pediatric oncology. As genomic testing is more standardly incorporated into childhood cancer care, communication with parents may need to adapt to reflect this. Our findings highlight potential opportunities to support parents in receiving information about genomic testing.