FoldX is an empirical force field that was developed for the rapid evaluation of the effect of mutations on the stability, folding and dynamics of proteins and nucleic acids. The core functionality of FoldX, namely the calculation of the free energy of a macromolecule based on its high-resolution 3D structure, is now publicly available through a web server at http://foldx.embl.de/. The current release allows the calculation of the stability of a protein, calculation of the positions of the protons and the prediction of water bridges, prediction of metal binding sites and the analysis of the free energy of complex formation. Alanine scanning, the systematic truncation of side chains to alanine, is also included. In addition, some reporting functions have been added, and it is now possible to print both the atomic interaction networks that constitute the protein, print the structural and energetic details of the interactions per atom or per residue, as well as generate a general quality report of the pdb structure. This core functionality will be further extended as more FoldX applications are developed.

Liquid-liquid phase separation (LLPS) of RNA-binding proteins plays an important role in the formation of multiple membrane-less organelles involved in RNA metabolism, including stress granules. Defects in stress granule homeostasis constitute a cornerstone of ALS/FTLD pathogenesis. Polar residues (tyrosine and glutamine) have been previously demonstrated to be critical for phase separation of ALS-linked stress granule proteins. We now identify an active role for arginine-rich domains in these phase separations. Moreover, arginine-rich dipeptide repeats (DPRs) derived from C9orf72 hexanucleotide repeat expansions similarly undergo LLPS and induce phase separation of a large set of proteins involved in RNA and stress granule metabolism. Expression of arginine-rich DPRs in cells induced spontaneous stress granule assembly that required both eIF2α phosphorylation and G3BP. Together with recent reports showing that DPRs affect nucleocytoplasmic transport, our results point to an important role for arginine-rich DPRs in the pathogenesis of C9orf72 ALS/FTLD.

Article3 September 2010free access Neurotoxicity of Alzheimer's disease Aβ peptides is induced by small changes in the Aβ42 to Aβ40 ratio Inna Kuperstein Inna Kuperstein Department for Molecular and Developmental Genetics, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Leuven, Belgium Center for Human Genetics, KULeuven, Leuven, BelgiumPresent address: Institut Curie, Département de Transfert, and INSERM, U900, Paris F-75248 France Search for more papers by this author Kerensa Broersen Kerensa Broersen Switch Laboratory, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Brussels, Belgium Vrije Universiteit Brussel (VUB), Brussels, Belgium Search for more papers by this author Iryna Benilova Iryna Benilova Department for Molecular and Developmental Genetics, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Leuven, Belgium Center for Human Genetics, KULeuven, Leuven, Belgium IMEC, Bioelectronic Systems Group, Heverlee, Belgium Search for more papers by this author Jef Rozenski Jef Rozenski Laboratory of Medicinal Chemistry, Rega Institute for Medical Research, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Wim Jonckheere Wim Jonckheere Switch Laboratory, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Brussels, Belgium Vrije Universiteit Brussel (VUB), Brussels, Belgium Search for more papers by this author Maja Debulpaep Maja Debulpaep Switch Laboratory, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Brussels, Belgium Vrije Universiteit Brussel (VUB), Brussels, Belgium Search for more papers by this author Annelies Vandersteen Annelies Vandersteen Switch Laboratory, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Brussels, Belgium Vrije Universiteit Brussel (VUB), Brussels, Belgium Search for more papers by this author Ine Segers-Nolten Ine Segers-Nolten Faculty of Science and Technology, Nanobiophysics, MESA+ Institute for Nanotechnology, MIRA Institute for Biomedical Technology and Technical Medicine, University of Twente, Enschede, The Netherlands Search for more papers by this author Kees Van Der Werf Kees Van Der Werf Faculty of Science and Technology, Nanobiophysics, MESA+ Institute for Nanotechnology, MIRA Institute for Biomedical Technology and Technical Medicine, University of Twente, Enschede, The Netherlands Search for more papers by this author Vinod Subramaniam Vinod Subramaniam Faculty of Science and Technology, Nanobiophysics, MESA+ Institute for Nanotechnology, MIRA Institute for Biomedical Technology and Technical Medicine, University of Twente, Enschede, The Netherlands Search for more papers by this author Dries Braeken Dries Braeken IMEC, Bioelectronic Systems Group, Heverlee, Belgium Search for more papers by this author Geert Callewaert Geert Callewaert IMEC, Bioelectronic Systems Group, Heverlee, Belgium Search for more papers by this author Carmen Bartic Carmen Bartic IMEC, Bioelectronic Systems Group, Heverlee, Belgium Department of Physics and Astronomy, Laboratory of Solid State Physics and Magnetism, KULeuven, Belgium Search for more papers by this author Rudi D'Hooge Rudi D'Hooge Laboratory of Biological Psychology, KULeuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Ivo Cristiano Martins Ivo Cristiano Martins Switch Laboratory, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Brussels, Belgium Vrije Universiteit Brussel (VUB), Brussels, BelgiumPresent address: Biomembranes Unit, Institute de Medicina Molecular (IMM), Av. Prof. Egas Moniz, Lisboa, Portugal Search for more papers by this author Frederic Rousseau Corresponding Author Frederic Rousseau Switch Laboratory, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Brussels, Belgium Vrije Universiteit Brussel (VUB), Brussels, Belgium Search for more papers by this author Joost Schymkowitz Corresponding Author Joost Schymkowitz Switch Laboratory, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Brussels, Belgium Vrije Universiteit Brussel (VUB), Brussels, Belgium Search for more papers by this author Bart De Strooper Corresponding Author Bart De Strooper Department for Molecular and Developmental Genetics, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Leuven, Belgium Center for Human Genetics, KULeuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Inna Kuperstein Inna Kuperstein Department for Molecular and Developmental Genetics, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Leuven, Belgium Center for Human Genetics, KULeuven, Leuven, BelgiumPresent address: Institut Curie, Département de Transfert, and INSERM, U900, Paris F-75248 France Search for more papers by this author Kerensa Broersen Kerensa Broersen Switch Laboratory, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Brussels, Belgium Vrije Universiteit Brussel (VUB), Brussels, Belgium Search for more papers by this author Iryna Benilova Iryna Benilova Department for Molecular and Developmental Genetics, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Leuven, Belgium Center for Human Genetics, KULeuven, Leuven, Belgium IMEC, Bioelectronic Systems Group, Heverlee, Belgium Search for more papers by this author Jef Rozenski Jef Rozenski Laboratory of Medicinal Chemistry, Rega Institute for Medical Research, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Wim Jonckheere Wim Jonckheere Switch Laboratory, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Brussels, Belgium Vrije Universiteit Brussel (VUB), Brussels, Belgium Search for more papers by this author Maja Debulpaep Maja Debulpaep Switch Laboratory, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Brussels, Belgium Vrije Universiteit Brussel (VUB), Brussels, Belgium Search for more papers by this author Annelies Vandersteen Annelies Vandersteen Switch Laboratory, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Brussels, Belgium Vrije Universiteit Brussel (VUB), Brussels, Belgium Search for more papers by this author Ine Segers-Nolten Ine Segers-Nolten Faculty of Science and Technology, Nanobiophysics, MESA+ Institute for Nanotechnology, MIRA Institute for Biomedical Technology and Technical Medicine, University of Twente, Enschede, The Netherlands Search for more papers by this author Kees Van Der Werf Kees Van Der Werf Faculty of Science and Technology, Nanobiophysics, MESA+ Institute for Nanotechnology, MIRA Institute for Biomedical Technology and Technical Medicine, University of Twente, Enschede, The Netherlands Search for more papers by this author Vinod Subramaniam Vinod Subramaniam Faculty of Science and Technology, Nanobiophysics, MESA+ Institute for Nanotechnology, MIRA Institute for Biomedical Technology and Technical Medicine, University of Twente, Enschede, The Netherlands Search for more papers by this author Dries Braeken Dries Braeken IMEC, Bioelectronic Systems Group, Heverlee, Belgium Search for more papers by this author Geert Callewaert Geert Callewaert IMEC, Bioelectronic Systems Group, Heverlee, Belgium Search for more papers by this author Carmen Bartic Carmen Bartic IMEC, Bioelectronic Systems Group, Heverlee, Belgium Department of Physics and Astronomy, Laboratory of Solid State Physics and Magnetism, KULeuven, Belgium Search for more papers by this author Rudi D'Hooge Rudi D'Hooge Laboratory of Biological Psychology, KULeuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Ivo Cristiano Martins Ivo Cristiano Martins Switch Laboratory, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Brussels, Belgium Vrije Universiteit Brussel (VUB), Brussels, BelgiumPresent address: Biomembranes Unit, Institute de Medicina Molecular (IMM), Av. Prof. Egas Moniz, Lisboa, Portugal Search for more papers by this author Frederic Rousseau Corresponding Author Frederic Rousseau Switch Laboratory, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Brussels, Belgium Vrije Universiteit Brussel (VUB), Brussels, Belgium Search for more papers by this author Joost Schymkowitz Corresponding Author Joost Schymkowitz Switch Laboratory, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Brussels, Belgium Vrije Universiteit Brussel (VUB), Brussels, Belgium Search for more papers by this author Bart De Strooper Corresponding Author Bart De Strooper Department for Molecular and Developmental Genetics, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Leuven, Belgium Center for Human Genetics, KULeuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Author Information Inna Kuperstein1,2,‡, Kerensa Broersen3,4,‡, Iryna Benilova1,2,5,‡, Jef Rozenski6, Wim Jonckheere3,4, Maja Debulpaep3,4, Annelies Vandersteen3,4, Ine Segers-Nolten7, Kees Van Der Werf7, Vinod Subramaniam7, Dries Braeken5, Geert Callewaert5, Carmen Bartic5,8, Rudi D'Hooge9, Ivo Cristiano Martins3,4, Frederic Rousseau 3,4, Joost Schymkowitz 3,4 and Bart De Strooper 1,2 1Department for Molecular and Developmental Genetics, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Leuven, Belgium 2Center for Human Genetics, KULeuven, Leuven, Belgium 3Switch Laboratory, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Brussels, Belgium 4Vrije Universiteit Brussel (VUB), Brussels, Belgium 5IMEC, Bioelectronic Systems Group, Heverlee, Belgium 6Laboratory of Medicinal Chemistry, Rega Institute for Medical Research, Leuven, Belgium 7Faculty of Science and Technology, Nanobiophysics, MESA+ Institute for Nanotechnology, MIRA Institute for Biomedical Technology and Technical Medicine, University of Twente, Enschede, The Netherlands 8Department of Physics and Astronomy, Laboratory of Solid State Physics and Magnetism, KULeuven, Belgium 9Laboratory of Biological Psychology, KULeuven, Leuven, Belgium ‡The authors contributed equally to this work *Corresponding authors: Switch Laboratory, Flanders Institute for Biotechnology (VIB) and Vrije Universiteit Brussel (VUB), Pleinlaan 2, Brussels 1050, Belgium. Tel.: +322 629 1025; Fax: +322 629 1942; E-mail: [email protected] Laboratory, Flanders Institute for Biotechnology (VIB) and Vrije Universiteit Brussel (VUB), Pleinlaan 2, Brussels 1050, Belgium. Tel.: +322 629 1025; Fax: +322 629 1942; E-mail: [email protected] for Human Genetics, Flanders Institute for Biotechnology (VIB) and KULeuven, Herestraat 49, Leuven 3000, Belgium. Tel.: +321 634 6227; Fax: +321 634 7181; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2010)29:3408-3420https://doi.org/10.1038/emboj.2010.211 Present address: Institut Curie, Département de Transfert, and INSERM, U900, Paris F-75248 France PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info The amyloid peptides Aβ40 and Aβ42 of Alzheimer's disease are thought to contribute differentially to the disease process. Although Aβ42 seems more pathogenic than Aβ40, the reason for this is not well understood. We show here that small alterations in the Aβ42:Aβ40 ratio dramatically affect the biophysical and biological properties of the Aβ mixtures reflected in their aggregation kinetics, the morphology of the resulting amyloid fibrils and synaptic function tested in vitro and in vivo. A minor increase in the Aβ42:Aβ40 ratio stabilizes toxic oligomeric species with intermediate conformations. The initial toxic impact of these Aβ species is synaptic in nature, but this can spread into the cells leading to neuronal cell death. The fact that the relative ratio of Aβ peptides is more crucial than the absolute amounts of peptides for the induction of neurotoxic conformations has important implications for anti-amyloid therapy. Our work also suggests the dynamic nature of the equilibrium between toxic and non-toxic intermediates. Introduction Amyloid β (Aβ) peptides generated from the amyloid precursor protein (APP) by β- and γ-secretase-mediated cleavage (Annaert and De Strooper, 2002) are thought to have an important function in the neurodegenerative process in Alzheimer's disease (AD) (Hardy and Selkoe, 2002). γ-Secretase cleavage of APP generates a heterogeneous mixture of Aβ peptides varying in length at their carboxytermini (Sato et al, 2003; Qi-Takahara et al, 2005; Kakuda et al, 2006). Additional heterogeneity is generated at the aminoterminus by aminopeptidases, glutaminylcyclases and other modifications (Pike et al, 1995; Saido et al, 1996) (reviewed in De Strooper, 2010). It has been proposed that some of these variations might contribute to the neurotoxic properties of Aβ peptides (Schilling et al, 2008). The major Aβ species recovered from serum, cerebrospinal fluid and cell culture supernatants is 40 amino acids long (Aβ40) (Haass and Selkoe, 1993; Scheuner et al, 1996). Interest in a second peptide, Aβ42, which is detected at about 10-fold lower levels, was strongly stimulated by the observation that familial AD causing mutations in the APP gene and/or in the gene encoding the γ-secretase complex component presenilin increased the relative production of Aβ42 relative to Aβ40 (Suzuki et al, 1994; Duff et al, 1996; Scheuner et al, 1996). We reported earlier (Bentahir et al, 2006) that clinical mutations in presenilin do not necessarily increase the production of Aβ, but that they mainly affect the spectrum of the Aβ peptides generated by γ-secretase. As patients with presenilin mutations present an early and aggressive form of the disease, it seems then logical to propose that the absolute quantity of Aβ peptides produced in the brain might be less important than the quality of the Aβ peptides (reflected in a changed Aβ42 to Aβ40 ratio) for the generation of elusive toxic Aβ species (De Strooper, 2007). The implications of such hypothesis for current efforts in drug development is important because lowering the absolute amounts of Aβ in patients would then be less crucial than the restoration of the correct ratios of Aβ peptides. Earlier studies have already provided evidence that Aβ40 and Aβ42 affect each other's aggregation rates and toxic effects (Snyder et al, 1994; Frost et al, 2003; Yoshiike et al, 2003; Wang et al, 2006; Kim et al, 2007; Yan and Wang, 2007; Jan et al, 2008). Generally, it is found that Aβ42 has fast aggregation kinetics, which can be inhibited by Aβ40 in a concentration-dependent manner. Interesting in vivo studies have further shown that increased levels of Aβ40 peptides in the brain actually might have a protective effect (Wang et al, 2006; Kim et al, 2007). In the past, a lot of attention has gone to the accumulation of Aβ in plaques and the relationship between amyloid plaques and AD. However, little or no correlation was found between the total burden of Aβ peptide deposited into plaques in the brain and the degree of neurodegeneration in the patients (Terry et al, 1991; Price and Morris, 1999). More recently, this discrepancy has been confirmed with modern amyloid imaging techniques (Aizenstein et al, 2008; Reiman et al, 2009). Obviously, it is possible that these patients are in a preclinical phase of the disease, and follow-up studies are underway to investigate this. Nevertheless, these observations support the concept that the amyloid fibrils are biologically largely inert and that not all conformations of Aβ are equally toxic (Martins et al, 2008; Shankar et al, 2008). A series of intermediate soluble aggregates of Aβ peptides, such as ‘Aβ-derived diffusible ligands’ (ADDLs) (Lambert et al, 1998) or ‘natural toxic oligomers’ (Walsh et al, 2002), have been identified. The mechanism of their neurotoxic activity remains not only subject of intense investigation, but also the precise conformation(s) of the toxic species remains uncertain (Kayed et al, 2003; Hepler et al, 2006). Dimers were proposed to potently disrupt synaptic plasticity (Klyubin et al, 2008; Shankar et al, 2008), an Aβ species of 56 kDa has been found neurotoxic in Tg2576 mice (Lesne et al, 2006), lipid-induced oligomers from mature fibrils (Martins et al, 2008), ADDLs (Lambert et al, 1998; Gong et al, 2003; Lacor et al, 2007) and annular assemblies (Lashuel et al, 2002) were shown to exert neurotoxic effects, affect synapse function and even memory formation in mice. It should be noted that in many of the publications, the identified toxic species are presented as stable, defined structures, although it seems logical to assume that their assembly and disassembly is a dynamic and continuous process, at least in the initial stages, and the alternative possibility that toxicity is present over a series of conformers or sizes should not be disregarded (Hepler et al, 2006; Martins et al, 2008; Ono et al, 2009). Toxicity seems to be higher with tetramers than dimers for instance (Ono et al, 2009). The question is thus how biophysical parameters influence this process in vivo and affect the relative distribution of Aβ species over toxic and non-toxic conformations over time. Given the complexity of the biophysical environment in which Aβ aggregation occurs in vivo, such question is extremely difficult to address. Nevertheless, it is possible to analyse the dynamic features of this process in simplified and controlled conditions in vitro, and to evaluate the effect of the relative concentrations of Aβ40 and Aβ42 to the generation of neurotoxic species over time. We hypothesized here that the early onset of AD by APP and/or presenilin mutations that increase the Aβ42:Aβ40 ratios can be explained by interactions between Aβ40 and Aβ42, which provide stability to intermediate, neurotoxic species. We used biophysical methods and a novel cellular assay to analyse the establishment of neurotoxicity over time in different Aβ mixtures. We found that very minor changes in the relative amount of Aβ42 versus Aβ40 (Aβ42:Aβ40) has dramatic effects on the dynamic behaviour of toxic Aβ species. Our findings provide an important biological addition to the original ‘Aβ42 seeding hypothesis’ (Jarrett and Lansbury, 1993), which focused on amyloid fibril formation. These dynamic oligomeric species exhibit initial synaptotoxicity and cause later neurotoxicity in primary hippocampal neurons and affect memory formation in mice, underlining their potential importance for the understanding of AD. Results As the objective of this study was to investigate how Aβ40 and Aβ42 affect each others’ biophysical and biological properties, it was important to prepare a pre-aggregate-free Aβ solution and to validate the mixtures using mass spectrometry (Supplementary Figure) and anti-Aβ40- and anti-Aβ42-specific antibodies (Supplementary Figure 1E). We found that the sequential treatment of 1,1,1,3,3,3-hexafluor-2-propanol (HFIP)-Aβ films (rPeptide) with HFIP, dimethyl sulphoxide (DMSO) and then removal of DMSO using a desalting column provide excellent results with mixtures of primarily monomeric peptides in the appropriate relative amounts (Supplementary Figure 1, see also Materials and methods). Fourier transform infrared (FTIR) spectroscopy validated the complete removal of all HFIP and DMSO (not shown). Aggregation rate of Aβ peptides is strongly influenced by the ratio Aβ42:Aβ40 Aβ peptide was incubated at a concentration of 50 μM in 50 mM Tris–HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5 at 25°C. The aggregation process of a range of Aβ42:Aβ40 ratios (10:0 to 0:10) tested by Thioflavin T (ThT) fluorescence yielded a typical sigmoidal curve as generally observed for aggregating proteins and peptides (Figure 1A shows four examples) (Harper and Lansbury, 1997). The formation of an Aβ nucleus, which is not reactive with the fluorescent ThT probe during the so-called ‘lag phase’, is followed by rapid elongation of ThT-positive Aβ aggregates to form fibrils (the ‘elongation phase’). Both the length of the lag phase and the rate of aggregation were affected by the ratio of Aβ42:Aβ40 (Figure 1B and C). The lag phase for pure Aβ40 alone was ∼2.5 h (±0.3 h). Addition of 10% Aβ42 (Aβ42:Aβ40=1:9) resulted in a small, but reproducible increase in the lag phase (∼2.9±0.3 h) (Figure 1B). A further increase in the Aβ42:Aβ40 ratio decreased paradoxically the length of the lag phase to ∼0.5±0.01 h. From a ratio of 3:7 onwards, no difference was observed compared with Aβ42 alone. The elongation rate was fastest for pure Aβ40 and was slowed down by addition of Aβ42 (Figure 1C). Remarkably, judging from the lag phase of aggregation, the 1:9 and the 3:7 ratio showed two opposite ends of the spectrum (Figure 1B). These ratios, in addition to 10:0 and 0:10 were selected for our further studies. The choice for 3:7 can be also rationalized as it reflects roughly the ratio of Aβ42 and Aβ40 in patients with familial AD (Duff et al, 1996; Mann et al, 1996; Scheuner et al, 1996; Citron et al, 1997). Thus, both time and the Aβ42:Aβ40 ratios are two important parameters when considering the biophysical properties of Aβ, and we decided to investigate how these parameters determine Aβ-oligomer toxicity. We describe in the rest of the paper the different Aβ mixtures as an Aβ42:Aβ40 ratio, incubated for an indicated time at an Aβ concentration of 100 μM in 50 mM Tris–HCl, 1 mM EDTA, pH 7.5 at 25°C. Thus, (3:7, 2 h) means a ratio of three Aβ42 versus seven Aβ40 peptides incubated for 2 h under given buffer conditions before addition to the cell culture. Final concentration of Aβ in cell culture is in most experiments 1 μM apart from a few in which 10 μM was used as indicated. On the basis of our further experiments, it appeared that at any time point only a small fraction of the peptides is in a toxic active conformation. Figure 1.Aβ42 determines the kinetics of Aβ aggregation. (A) Aggregation kinetics of 50 μM Aβ ratios in 50 mM Tris, 1 mM EDTA at 25°C for 6 h by Thioflavin T (ThT) assay shows how the ratio of Aβ42:Aβ40 (e.g. 3:7) influences the aggregation kinetics. The colour codes are maintained in all following figures. (B) Quantitative analysis of lag phase, showing the time (hours) of the initial part of curves as in (A), during which no increase in ThT fluorescence signal is detected using different Aβ42:Aβ40 ratios as indicated. (C) Quantitative analysis of the elongation rate, derived from (A) as rate of fluorescence change, which is the slope of the linear phase of exponential growth in (A), using different Aβ ratios as indicated. Numbers are averages of three independent experiments. Error flags indicate s.d. calculated over the three independent experiments. Statistical significance of the results was established by P-values using paired two-tailed t-tests, and only shown for the four ratios further studied in the text. Statistical significance levels were in (B, C): *P<0.005, **P<0.001, ***P<0.0001. P-value of Aβ40 (0:10) and (1:9)=0.09, and P-value of Aβ40 (0:10) and (1:9)=0.0058 in panels B and C, respectively. Download figure Download PowerPoint The Aβ42:Aβ40 ratio is a driver of acute synaptic alterations One problem with Aβ toxicity assays is the delay between the actual preparation of the oligomer samples used for the biophysical analysis and the moment when the biological read out becomes available to assess the neurotoxicity. We, therefore, sought to set up an assay that allows verifying biological effects of Aβ preparations within the time frame of the biophysical experiments. We plated mouse hippocampal neurons on microelectrode array (MEA)-based chips (Figure 2A) (Stett et al, 2003) and recorded spontaneous firing rates in the neuronal networks before and after treatment with Aβ mixtures at a final concentration of 1 μM. Representative traces of responses of cultures treated with different Aβ mixtures are displayed in Figure 2B. Interestingly, treatment with pure Aβ40 mixtures (0:10, 2 h) appeared to enhance synaptic activity measured as spontaneous firing rate, whereas (1:9, 2 h) mixtures had no effect on spontaneous synaptic activity (Figure 2B and C). In contrast, Aβ42 alone (10:0, 2 h) or with Aβ40 (3:7, 2 h) readily suppressed spontaneous neuronal activity within 40 min after addition of the peptides (Figure 2B and C). As a control of the oligomers species status during the course of the recording, we followed changes in fluorescent ThT emission over 40 min of Aβ mixtures at 1 μM in neuronal culture medium at 37°C, which mimics the conditions of the cell culture experiments (Figure 2D). The Aβ mixtures appeared stable over the time frame of the experiment at least as far as it concerns ThT incorporation. We next assayed how different Aβ42:Aβ40 ratios evolve over time with regard to synaptotoxic properties. Aβ42:Aβ40 ratio mixtures were incubated for 0, 1.5, 4, 6 and 20 h before addition to the cultures. Synaptic firing rates were recorded for 40 min as above using MEA. Figure 2E shows that synaptic effects were little after treatment of the cells with mixtures of Aβ shortly after dissolving them in buffer (t=0 h, Figure 2E). Toxicity was, however, already significantly high after 1.5 h of aggregation in the (3:7, 1.5 h) and the (10:0, 1.5 h) mixtures. The synaptotoxic potential in the (3:7) and (10:0) ratios remained stable up to 20 h (Figure 2E). Remarkably, 1:9 or 0:10 ratios did not result in major synaptic effects at any incubation point (Figure 2E). To validate the findings, we performed double immunostaining for the synaptic marker synaptophysin and Aβ oligomers using the A11 antibody (Kayed et al, 2003). Figure 2F shows that Aβ (3:7) and Aβ (10:0) mainly co-localized with the synaptic marker, whereas staining was not observed with the (1:9) and (0:10) ratio. Extensive washing of the neurons to remove Aβ species did not interfere with consecutive A11 staining, indicating the rather irreversible nature of the binding of these synaptic active species to the neurons (not shown). Figure 2.Mixed Aβ oligomers result in a rapid synaptotoxic response in primary neurons. (A) Neurons stained with Fluo-4 were cultured 8 days in vitro (DIV) on the MEA chip. (B) Firing pattern of neurons from representative electrodes at 0, 10, 20 and 40 min treatment with different Aβ ratios prepared as indicated (e.g. 0:10, 2 h means an Aβ42:Aβ40 ratio of 0 versus 10, and 2 h means 2 h incubation before addition to the culture). Note the significantly decreased firing rate and amplitude for Aβ42:Aβ40 ratios 10:0 and 3:7 after 20 min of treatment. (C) Spontaneous electrical synaptic activity recordings of hippocampal neurons during 40 min of treatment with 1 μM Aβ ratios incubated for 2 h prior to the addition to cells. Values are per cent of initial firing rate±s.e.m. of 3–5 independent experiments. Statistical significance (unpaired two-tailed t-test) of the data versus control is indicated by *P<0.01 or **P<0.001 in the figure. Notice that a strong reduction in spontaneous synaptic firing versus correspondent control (buffer-treated chips) can be observed after 20 and 40 min in the medium of the 3:7 and 10:0 Aβ42:Aβ40 ratios. (D) Oligomers dissolved in culture medium remain stable with regard to ThT tinctorial properties for at least 40 min. Aβ ratios were prepared and at specific time intervals of incubation, that is 0, 1.5, 4 and 22 h, Aβ aliquots were removed and diluted to 1 μM in cell culture medium containing ThT. The stability of the aggregates at 37°C in cell culture medium was deduced from the stability of the ThT signal over 40 min. Blue bars represent different Aβ42:Aβ40 ratios as indicated in the figure. Compare signals directly upon dilution into cell culture medium (‘0 min’) at 37°C with signals obtained after 40 min incubation at 37°C (‘40 min’). Values are averages of three experiments. (E) Different ratios of Aβ peptides were generated and added to neuronal cultures diluted to a final concentration of 1 μM, either immediately (0 h) or after 1.5 h; 4 h, 6 h or 20 h of incubation. Synaptotoxicity was measured by recording a decreased rate of firing 40 min after adding the Aβ mixtures to the neurons. Statistical significance levels determined as a function of s.e.m.: ***P<0.0001, n=6 chips, **P<0.001, n=3 chips, *P<0.01, n=3 chips, difference between 6 h ratio (3:7) and (10:0): *P<0.012 (unpaired two-tailed t-test). (F) Synaptic localization of mixed Aβ oligomers. Fluorescence microscopy images of hippocampal neurons stained for synaptophysin (red) and Aβ oligomers (A11 antibody) (green) after 1 h treatment with 1 μM of the indicated Aβ ratios, incubated for 2 h prior the addition to cells. Right panel: magnification of selected region stained with synaptophysin (red) and Aβ oligomers (A11 antibody, green). Oligomeric Aβ co-localizes with synapses. (G) Rescue of spontaneous electrical synaptic activity after the treatment with ratio (10:0, 2 h) in the presence or absence of anti-oligomer A11 or anti-Aβ 6E10 antibody, final concentration 10 μg ml–1. Values are per cent of initial firing rate±s.e.m., of three independent experiments, except for the control with non-specific antibody, which was performed only once. (H) Example of firing recovery after treatment with 10 μM (10:0, 2 h). Raw data streams are shown in black, and corresponding spike shapes are in red. The treatment completely inhibited spontaneous activity in 6 min. Then the medium was refreshed, and signals were measured after overnight recovery (18 h). Note partial restoration of initial firing profile along with appearance of another spike population endowed with slightly different waveform and amplitude. Spike sorting is performed in MC Rack software. Download figure Download PowerPoint To prove Aβ specificity of the observed effects, we pre-incubated cells with anti-oligomer A11 or anti-Aβ antibody 6E10 before treatment with Aβ (10:0, 2 h) ratio. The alterations in the synaptic activity by toxic intermediates are indeed Aβ specific, as cells pre-incubated with antibodies are no longer susceptible to the neurotoxic effects (Figure 2G). We also further explored the reversibility of these Aβ effects on synapti

Article13 April 2012Open Access The mechanism of γ-Secretase dysfunction in familial Alzheimer disease Lucía Chávez-Gutiérrez Lucía Chávez-Gutiérrez VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Leen Bammens Leen Bammens VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Iryna Benilova Iryna Benilova VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Annelies Vandersteen Annelies Vandersteen Faculty of Science and Technology, MIRA Institute for Biomedical Technology and Technical Medicine, University of Twente, AE Enschede, The Netherlands Switch Laboratory, Department of Cellular and Molecular Medicine, KULeuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Manasi Benurwar Manasi Benurwar VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Marianne Borgers Marianne Borgers VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Sam Lismont Sam Lismont VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Lujia Zhou Lujia Zhou VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Simon Van Cleynenbreugel Simon Van Cleynenbreugel VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Hermann Esselmann Hermann Esselmann Department of Psychiatry and Psychotherapy, LVR-Clinics Essen, University of Duisburg-Essen, Essen, Germany Search for more papers by this author Jens Wiltfang Jens Wiltfang Department of Psychiatry and Psychotherapy, LVR-Clinics Essen, University of Duisburg-Essen, Essen, Germany Search for more papers by this author Lutgarde Serneels Lutgarde Serneels VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Eric Karran Eric Karran Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Harrie Gijsen Harrie Gijsen Janssen Research & Development, a Division of Janssen Pharmaceutica NV, Beerse, Belgium Search for more papers by this author Joost Schymkowitz Joost Schymkowitz VIB Switch Laboratory, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Frederic Rousseau Frederic Rousseau Switch Laboratory, Department of Cellular and Molecular Medicine, KULeuven, Leuven, Belgium VIB Switch Laboratory, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Kerensa Broersen Kerensa Broersen Faculty of Science and Technology, MIRA Institute for Biomedical Technology and Technical Medicine, University of Twente, AE Enschede, The Netherlands Vrije Universiteit Brussel, Brussel, Belgium Search for more papers by this author Bart De Strooper Corresponding Author Bart De Strooper VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Lucía Chávez-Gutiérrez Lucía Chávez-Gutiérrez VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Leen Bammens Leen Bammens VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Iryna Benilova Iryna Benilova VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Annelies Vandersteen Annelies Vandersteen Faculty of Science and Technology, MIRA Institute for Biomedical Technology and Technical Medicine, University of Twente, AE Enschede, The Netherlands Switch Laboratory, Department of Cellular and Molecular Medicine, KULeuven, Leuven, Belgium Search for more papers by this author Manasi Benurwar Manasi Benurwar VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Marianne Borgers Marianne Borgers VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Sam Lismont Sam Lismont VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Lujia Zhou Lujia Zhou VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Simon Van Cleynenbreugel Simon Van Cleynenbreugel VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Hermann Esselmann Hermann Esselmann Department of Psychiatry and Psychotherapy, LVR-Clinics Essen, University of Duisburg-Essen, Essen, Germany Search for more papers by this author Jens Wiltfang Jens Wiltfang Department of Psychiatry and Psychotherapy, LVR-Clinics Essen, University of Duisburg-Essen, Essen, Germany Search for more papers by this author Lutgarde Serneels Lutgarde Serneels VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Eric Karran Eric Karran Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Harrie Gijsen Harrie Gijsen Janssen Research & Development, a Division of Janssen Pharmaceutica NV, Beerse, Belgium Search for more papers by this author Joost Schymkowitz Joost Schymkowitz VIB Switch Laboratory, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Frederic Rousseau Frederic Rousseau Switch Laboratory, Department of Cellular and Molecular Medicine, KULeuven, Leuven, Belgium VIB Switch Laboratory, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Kerensa Broersen Kerensa Broersen Faculty of Science and Technology, MIRA Institute for Biomedical Technology and Technical Medicine, University of Twente, AE Enschede, The Netherlands Vrije Universiteit Brussel, Brussel, Belgium Search for more papers by this author Bart De Strooper Corresponding Author Bart De Strooper VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium Search for more papers by this author Author Information Lucía Chávez-Gutiérrez1,2, Leen Bammens1,2, Iryna Benilova1,2, Annelies Vandersteen3,4, Manasi Benurwar1,2, Marianne Borgers1,2, Sam Lismont1,2, Lujia Zhou1,2, Simon Van Cleynenbreugel1,2, Hermann Esselmann5, Jens Wiltfang5, Lutgarde Serneels1,2, Eric Karran2, Harrie Gijsen6, Joost Schymkowitz7, Frederic Rousseau4,7, Kerensa Broersen3,8 and Bart De Strooper 1,2 1VIB Center for the Biology of Disease, Leuven, Belgium 2Center for Human Genetics (CME) and Leuven Institute for Neurodegenerative Diseases (LIND), University of Leuven (KUL), Leuven, Belgium 3Faculty of Science and Technology, MIRA Institute for Biomedical Technology and Technical Medicine, University of Twente, AE Enschede, The Netherlands 4Switch Laboratory, Department of Cellular and Molecular Medicine, KULeuven, Leuven, Belgium 5Department of Psychiatry and Psychotherapy, LVR-Clinics Essen, University of Duisburg-Essen, Essen, Germany 6Janssen Research & Development, a Division of Janssen Pharmaceutica NV, Beerse, Belgium 7VIB Switch Laboratory, Flanders Institute for Biotechnology (VIB), Leuven, Belgium 8Vrije Universiteit Brussel, Brussel, Belgium *Corresponding author. VIB, Center for the Biology of Disease, Center for Human Genetics, University of Leuven (KUL), Herestraat 49, Leuven, Flanders B-3000, Belgium. Tel.:+32 16 346227; Fax:+32 16 347181; E-mail: [email protected] The EMBO Journal (2012)31:2261-2274https://doi.org/10.1038/emboj.2012.79 There is a Have you seen? (May 2012) associated with this Article. PDFDownload PDF of article text and main figures. Peer ReviewDownload a summary of the editorial decision process including editorial decision letters, reviewer comments and author responses to feedback. ToolsAdd to favoritesDownload CitationsTrack CitationsPermissions ShareFacebookTwitterLinked InMendeleyWechatReddit Figures & Info The mechanisms by which mutations in the presenilins (PSEN) or the amyloid precursor protein (APP) genes cause familial Alzheimer disease (FAD) are controversial. FAD mutations increase the release of amyloid β (Aβ)42 relative to Aβ40 by an unknown, possibly gain-of-toxic-function, mechanism. However, many PSEN mutations paradoxically impair γ-secretase and ‘loss-of-function’ mechanisms have also been postulated. Here, we use kinetic studies to demonstrate that FAD mutations affect Aβ generation via three different mechanisms, resulting in qualitative changes in the Aβ profiles, which are not limited to Aβ42. Loss of ε-cleavage function is not generally observed among FAD mutants. On the other hand, γ-secretase inhibitors used in the clinic appear to block the initial ε-cleavage step, but unexpectedly affect more selectively Notch than APP processing, while modulators act as activators of the carboxypeptidase-like (γ) activity. Overall, we provide a coherent explanation for the effect of different FAD mutations, demonstrating the importance of qualitative rather than quantitative changes in the Aβ products, and suggest fundamental improvements for current drug development efforts. Introduction A central and still unresolved debate with important therapeutic implications in the field of Alzheimer disease (AD) research revolves around the question of how mutations in presenilin (PSEN), the catalytic core of the γ-secretases (De Strooper et al, 1998), cause disease. The γ-secretases are intramembrane cleaving protein complexes (Hebert et al, 2004; Shirotani et al, 2004) responsible for the generation of amyloid β (Aβ) from the amyloid precursor protein (APP). Aβ peptides of different lengths accumulate in amyloid plaques in the AD brain. More than 150 familial Alzheimer disease (FAD) mutations have been mapped to the genes encoding PSEN1 or PSEN2 (http://www.molgen.ua.ac.be/ADMutations), pointing to a crucial role of the γ-secretase complexes in the disease. Apart from PSEN, a mature and active γ-secretase complex consists of three additional subunits: Nicastrin (Nct), PSEN enhancer 2 (Pen-2), and either anterior pharynx 1 (APH-1) A or B (for a review, see Tolia and De Strooper, 2009). The γ-secretase complexes proteolyse type 1 transmembrane proteins, among them the APP, the Notch receptors and ligands, the Erb4 receptor and N-Cadherin (Wakabayashi and De Strooper, 2008). As a rule, FAD PSEN mutations increase the relative amount of Aβ42 versus Aβ40 in in vivo and in vitro paradigms (Borchelt et al, 1996; Duff et al, 1996; Scheuner et al, 1996; Murayama et al, 1999), which led to propose that PSEN mutations act via a toxic gain-of-function mechanism. However, more refined analyses have made clear that the change in Aβ ratio does not necessarily reflect an increase in Aβ42 production, but can also be the consequence of a decrease in Aβ40 levels. Actually, many mutations reduce one or both products of the γ-secretase in steady-state conditions (Song et al, 1999; Bentahir et al, 2006; Shen and Kelleher, 2007; Shimojo et al, 2007; Heilig et al, 2010). These observations have led to an opposite hypothesis in which FAD mutations in PSEN cause dementia through a loss of function of γ-secretase, resulting in decreased proteolytic processing of different substrates and compromising intracellular signalling pathways (Shen and Kelleher, 2007; Kelleher and Shen, 2010). In fact, the current model for γ-secretase successive proteolysis (Takami et al, 2009) may link a loss of function to misprocessing of APP and abnormal generation of Aβ (De Strooper, 2007; Wolfe, 2007). However, the fact that less efficient proteolytic processing of APP may lead to alterations in the Aβ profile and AD is contraintuitive in the light of the classical amyloid hypothesis, which stresses the importance of quantitative accumulation of either total Aβ or Aβ42 (Hardy and Selkoe, 2002). Moreover, a recent report has shown that reduced γ-secretase activity does not increase the production (accumulation) of longer Aβ peptides (Quintero-Monzon et al, 2011). Importantly, the biophysical and biochemical properties of Aβ vary strongly with its length. Longer Aβ42 has a much stronger tendency to aggregate than the shorter Aβ40 (Jarrett and Lansbury, 1993; Jarrett et al, 1993). Furthermore, the relative ratio of Aβ40 to Aβ42 influences strongly the biological effects of the Aβ mixture in vitro and in vivo, even when total Aβ amounts are kept equal (Kuperstein et al, 2010). Whereas Aβ40 appears to act protectively in various toxicity assays (Wang et al, 2006; Kim et al, 2007), longer Aβ peptides promote aggregation and neurotoxicity (McGowan et al, 2005). In fact, it has been suggested that the ratio (Aβ42/Aβ40) is more important than the absolute amounts of Aβ42 (Tanzi and Bertram, 2005). Similar to Aβ42, Aβ43 is potently amyloidogenic and neurotoxic (Saito et al, 2011). While it is commonly found in AD brains (Welander et al, 2009), its potential relevance in disease was only recently addressed (Saito et al, 2011). Thus, qualitative changes in Aβ (De Strooper, 2007; Wolfe, 2007) are at least as important as the quantitative alterations proposed by the original amyloid hypothesis (Hardy and Selkoe, 2002). In contrast, the ‘simple’ loss-of-function hypothesis proposes that Aβ alterations are only an epiphenomenon of the PSEN mutations, and that inefficient cleavage of membrane proteins by γ-secretase complexes is the fundamental upstream cause of the neurodegenerative process (Shen and Kelleher, 2007; Kelleher and Shen, 2010). This hypothesis finds support in (a) experimental results with Psen knockout mice (Saura et al, 2004), where progressive neurodegeneration occurs without Aβ deposition, and (b) in three case reports in which missense mutations in PSEN genes displayed neurodegenerative clinical phenotypes but no Aβ accumulation (discussed in Shen and Kelleher, 2007; Kelleher and Shen, 2010). However, this last argument has been considerably weakened by follow-up studies showing that neurodegeneration was likely caused by a second mutation in the progranulin gene in one case (Boeve et al, 2006), whereas in a second case abundant amyloid deposition in the frontal lobe appeared at autopsy (for further discussion, see Bergmans and De Strooper, 2010). On the other hand, recent observations in patients suffering from familial acne inversa in China (Wang et al, 2010) and independently in Great Britain (Pink et al, 2011) raise doubts about the validity of the ‘simple’ γ-secretase loss-of-function hypothesis. This condition appears to be associated with the haploinsufficiency of γ-secretase subunit genes (Nicastrin, Pen2) and most likely involves a deficiency in Notch cell signalling. However, none of the acne-affected individuals had AD symptoms. These observations indicate that reduced γ-secretase activity is not sufficient to cause AD, although further follow-up studies in these families are needed. Alternative mechanisms for the loss-of-function hypothesis have been proposed over the years (for an overview, see De Strooper and Annaert, 2010). For instance, several reports indicate alterations in subcellular trafficking or turnover of selected membrane proteins (Wilson et al, 2004; Esselens et al, 2004) or defective acidification of phagolysosomal compartments associated with PSEN loss of function (Lee et al, 2010). In addition, disturbances in cellular Ca2+ homeostasis by direct effects on the Ca2+ leakage function of PSEN (Zhang et al, 2010) or indirect effects on Ca2+ signalling pathways (reviewed in Bezprozvanny and Mattson, 2008) have been associated to PSEN loss of function. However, these hypotheses do not provide an explanation for the mutations in APP and also do not take into account that all tested FAD mutations affect the prime function of PSEN, which is proteolysis. From this brief overview it is clear that further in-depth investigation of the effects of clinical mutations on the function and structure of γ-secretase is required, especially given the relevance of such analysis for further drug development. Addressing this important question implies multidisciplinary approaches, in which deep structural and functional studies dissect the mechanisms of FAD mutations. Solving the 3D-structure of the protease complex would allow studying how FAD mutations affect the structure, and possibly the function. However, this is a huge challenge as important technical and experimental barriers need to be overcome. On the other hand, dissecting γ-secretase activity by kinetic analysis can yield important mechanistic insights into how FAD mutants regulate enzyme function. In vitro reconstitution of γ-secretase activity has provided initial insights into the enzymatic mechanism. Ihara and co-workers have provided compelling evidence for sequential processing of substrates by γ-secretase (Sato et al, 2003; Qi-Takahara et al, 2005; Kakuda et al, 2006; Yagishita et al, 2008). The most direct evidence was the identification of particular tri- and tetra-peptides generated from the APP-CTF stub by the γ-secretase (Takami et al, 2009). Their model proposes that APP can be sequentially cut along two production lines: Aβ49>Aβ46>Aβ43>Aβ40 and Aβ48>Aβ45>Aβ42>Aβ38 (Figure 1A). Accordingly, the endoproteolytic activity (first ε-cleavage) releases the APP intracellular domain (AICD) and Aβ48 or Aβ49. These long Aβs are then shortened by consecutive carboxypeptidase-like γ-cleavages, which progressively decrease Aβ hydrophobicity and increase the probability of its release into the extracellular environment. In agreement, it has been shown that the endoproteolytic cleavage site determines the product line preference of the γ-secretase in vivo (Funamoto et al, 2004), and therefore the series of Aβ products. Also, presenilinase cleavage (the autocatalytic activation of PSEN) results in the generation of tripeptides in accordance with this model (Fukumori et al, 2010). The ε-cleavage in the APP substrate is analogous to the Notch S3 cleavage site (Sastre et al, 2001; Weidemann et al, 2002) and most likely other γ-secretase substrates are processed in similar ways. Figure 1.FAD–PSEN1 mutations do not consistently decrease the enzymatic efficiency of the endopeptidase cleavage. (A, B) Schematic overviews of APP processing and location of FAD–PSEN1 mutations used in the current study. (C) Expression levels of Nct, PSEN1–NTF, PSEN1–CTF and Pen-2 in Psen1/2−/− mEFs transduced with human wt or FAD–PSEN1 mutants using a replication-defective recombinant retroviral expression system (Clontech) and selected with puromycin (5 μg/ml). Western blotting and densitometric analysis of the CHAPSO-solubilized membrane proteins from the different PSEN1 cell lines indicate that wt and mutant PSEN1 rescued γ-secretase complex to similar extents. In order to determine specific activities for the wt or FAD complexes, γ-secretase activities were normalized to PSEN CTF fragment levels or full-length PS1 levels for the DE9 mutant. (D) Kinetic curves for wt and PS1–FAD mutants using purified APP-C99-3XFLAG or Notch-3XFLAG substrates (mean±s.e.) or (F) ErB4-3XFLAG and N-Cadherin-3XFLAG substrates (mean±s.d.). Detergent-extracted membranes were incubated in 0.25% CHAPSO reaction buffer with varying concentrations of purified substrate for 4 h at 37 °C. In vitro generated ICD-3XFLAG were analysed by quantitative western blot analysis (see Materials and methods). (E) FAD–PSEN1 ε-enzymatic efficiencies for APP-C99 and Notch substrates (mean±s.e.). Enzymatic efficiencies unequivocally demonstrate that loss of function at the ε-cleavage is not a constant among PSEN1 mutations. (G) FAD–PSEN1 mutations that did not affect the generation of NICD did not change significantly the processing of ErB4 (mean±s.d.) either. In contrast, N-Cadherin processing was significantly upregulated by the M139V (mean±s.d.). (E, G) Experiments were repeated 3–5 times. Statistical significance of the data was tested with one-way analysis of variance (ANOVA) and Dunnett's post test, taking the corresponding WT efficiency as control group, *P<0.05. Download figure Download PowerPoint In the current study, we used a cell-free assay to analyse how clinical mutations in PSEN1, PSEN2 and APP affect the activity of the γ-secretase complex. Dissection of the different activities of the γ-secretase complex allowed us to reach a coherent explanation for the effects of the tested FAD mutations. We coupled kinetic studies of the endopeptidase activity to the analysis of the carboxypeptidase-like cleavage to show that FAD mutations have widely variable effects on the efficiency of the first cleavage, which releases the intracellular signalling domains of substrates. This observation rules out an impairment in the endopeptidase (ε) mechanism as necessary for the pathological effect of FAD mutations. In contrast, all FAD PSEN and APP mutations alter the processing of APP, regulating the generation of Aβ by three different mechanisms. Results FAD–PS1 mutations do not consistently impair the endopeptidase activity of the γ-secretase We analysed the effects of FAD mutations PSEN1-Y115H, -M139V, -L166P, -I213T, -G384A and delta-exon9 (DE9) on the kinetic constants of the ε-cleavage of APP, Notch, ErB4 and N-Cadherin substrates. The selected mutations are spread throughout the PSEN1 primary sequence (Figure 1B). Importantly, blockage by the transition state analogue L-685,458 (TSA, InhX) demonstrated the specificity of the assays (Supplementary Figure 1A). To determine the kinetic constants of wt and FAD γ-secretase complexes, we used CHAPSO-extracted membranes from Psen1/2−/−, rescued with wt or FAD-mutant PSEN1 as source of enzyme (Figure 1C) and purified APP C99–3XFlag, Notch–3XFlag, Erb4–3XFlag or N-Cadherin–3XFlag as substrates. The kinetic data fit the Michaelis–Menten reaction curves (Figure 1D and F), and Km (affinity constant) as well as Vmax (maximal velocity) were determined (Table I). Since γ-secretase activities are normalized to enzyme levels, Vmax can be taken as kcat and enzymatic efficiencies calculated as kcat/Km. The results reveal diverse effects of the FAD–PSEN1 mutations on this important kinetic parameter. Y115H, L166P and G384A mutants decrease γ-secretase efficiencies by 75% for both APP and Notch, while I213T and DE9 only affect APP, and M139V does not show any effect on the ε-cleavage (Figure 1E). Moreover, FAD–PSEN1 mutations that do not affect Notch endoproteolysis do not impair ErB4 cleavage either, while only the M139V significantly increases the processing of N-Cadherin (Figure 1G). Thus, the tested FAD–PSEN1 mutations have no consistent inhibitory effect on the endoproteolytic cleavage of γ-secretase substrates, indicating that reduced release of intracellular domains and signalling cannot explain their AD-causing effects. Table 1. Kinetic parameters for human PSEN1 γ-secretase complexes using APP-C99, Notch, ErB4 or N-Cadherin as substrates APP-C99 substrate Notch substrate Erb4 substrate N-Cadherin substrate Km±s.e., μM Vmax±s.e., pM/min Km±s.e., μM Vmax±s.e., pM/min Km±s.d., μM Vmax±s.d., pM/min Km±s.d., μM Vmax±s.d., pM/min PS1 wt 0.40±0.05 175.6±8.4 1.08±0.17 95.7±7.5 0.31±0.07 37.72±6.18 1.46±0.36 88.37±10.95 Y115H 0.81±0.18 113.3±11.3a 3.92±1.97 86.49±31.4 — — — — M139V 0.27±0.04a 144.5±6.8a 1.78±0.21a 146.9±10.1a 0.40±0.23 39.76±6.36 0.42±0.19a 71.16±20.14 L166P 0.43±0.07 74.03±4.2a 0.97±0.2 23.76±2.4a — — — — I213T 0.73±0.18 151.1±14.7 1.26±0.26 106.1±11.2 0.45±0.13 58.68±5.83a 1.02±0.11 74.95±11.76 DeltaE9 0.82±0.18a 133.5±13.5a 0.67±0.24 42.8±6.5a 0.33±0.06 40.84±8.12 1.70±0.43 21.97±8.39a G384A 0.92±0.18 93.87±8.7a 1.85±0.42 71.04±9.5 — — — — Kinetic values are derived from the curves displayed in Figure 1 and were determined by nonlinear curve-fitting using GraphPad Prism 4 software (see Material and methods section). a Significant changes according to the 95% CI (P<0.05). In vitro activity assays were performed using CHAPSO-extracted membranes from Psen1/2−/− mEFs stably transduced with human wt or FAD PSEN1 mutants and purified substrates-3XFlag, n⩾. FAD–PSEN mutations impair the fourth γ-secretase cleavage in both product lines Next, we asked whether FAD–PSEN1 mutations lead to APP misprocessing at the γ-cleavage sites. We use Ihara's model (see Introduction) for further description of our work since it explains very well our observations. Kinetic analysis of the carboxypeptidase-like activity is challenging to perform since controlling substrate concentrations, that is, the intermediary Aβ products, is experimentally not possible yet. Nevertheless, we measured two γ-products in each production line: Aβ43, Aβ42, Aβ40 and Aβ38 (Figure 1A) at saturating APP-substrate concentration. Thus, substrates (Aβ43 and Aβ42) and products (Aβ40 and Aβ38) of the fourth γ-secretase cleavage in both pathways are analysed and provide a relative number for the γ-cleavage efficiency. Importantly, as some of the clinical mutants affect the ε-cleavage, we normalized the Aβ product levels (Aβ38, Aβ40, Aβ42 or Aβ43) towards total AICD (Figure 2A and B). AICD reflects the total initial Aβ substrate (Aβ49+Aβ48) produced and processed in each reaction. Low Aβ40 and Aβ38 levels and high, long Aβ levels (>Aβ42) are found in all the FAD-linked mutations tested, including the M139V, which does not affect the ε-efficiency. Interestingly, the M139V mutation affects the processing of APP only at the level of Aβ, indicating that endo- and carboxypeptidase-like activities of the γ-secretase can be dissociated. Figure 2.FAD–PSEN1 mutations impair the fourth enzymatic turnover. AICD levels (moles per min) generated by the wt or FAD mutant complexes (A) were used to normalize Aβ products (moles per min) in order to determine accurately Aβ generation relative to C99 substrate. Aβ profiles (B) thus represent Aβ products corrected for the initial endoprotease activities, plotted as percentage of the wt Aβ products (mean±s.e.). Soluble Aβ (sum of Aβ38, Aβ40, Aβ42 and Aβ43 peptides) gives information about the efficiency of the γ-cleavages: lower levels (<100%, grey box) suggest that longer peptides (>Aβ43) accumulate in the reactions. (C) In agreement with the ELISA quantifications, total Aβ analysed in urea-based gels show increments in Aβ42 and Aβ43, and reductions in Aβ40 and Aβ38 in FAD–PSEN1 mutations, relative to wt. (*) Indicates a non product band that is present in the C99 substrate (see Supplementary Figure 2). (D) Aβ product/substrate ratios determined in vitro for the FAD–PSEN1 mutations show an impairment at the fourth γ-secretase turnover (mean±s.e.). Experiments in (B) and (D) were repeated 4–6 times. Statistical significance of the data tested with one-way ANOVA and Dunnett's post test taking the corresponding WT as control group; *P<0.05, **P<0.01. (E) Aβ product/substrate ratios determined in vivo confirm impairment at the fourth enzymatic cycle: wt or FAD–PSEN1 mEF cell lines were transiently transduced with APPswe, extracellular media collected at 24

How the thermodynamic stability effects of protein mutations (DeltaDeltaG) are distributed is a fundamental property related to the architecture, tolerance to mutations (mutational robustness), and evolutionary history of proteins. The stability effects of mutations also dictate the rate and dynamics of protein evolution, with deleterious mutations being the main inhibitory factor. Using the FoldX algorithm that attempts to computationally predict DeltaDeltaG effects of mutations, we deduced the overall distributions of stability effects for all possible mutations in 21 different globular, single domain proteins. We found that these distributions are strikingly similar despite a range of sizes and folds, and largely follow a bi-Gaussian function: The surface residues exhibit a narrow distribution with a mildly destabilizing mean DeltaDeltaG ( approximately 0.6 kcal/mol), whereas the core residues exhibit a wider distribution with a stronger destabilizing mean ( approximately 1.4 kcal/mol). Since smaller proteins have a higher fraction of surface residues, the relative weight of these single distributions correlates with size. We also found that proteins evolved in the laboratory follow an essentially identical distribution, whereas de novo designed folds show markedly less destabilizing distributions (i.e. they seem more robust to the effects of mutations). This bi-Gaussian model provides an analytical description of the predicted distributions of mutational stability effects. It comprises a novel tool for analyzing proteins and protein models, for simulating the effect of mutations under evolutionary processes, and a quantitative description of mutational robustness.

A growing number of proteins are being identified that are biologically active though intrinsically disordered, in sharp contrast with the classic notion that proteins require a well-defined globular structure in order to be functional. At the same time recent work showed that aggregation and amyloidosis are initiated in amino acid sequences that have specific physico-chemical properties in terms of secondary structure propensities, hydrophobicity and charge. In intrinsically disordered proteins (IDPs) such sequences would be almost exclusively solvent-exposed and therefore cause serious solubility problems. Further, some IDPs such as the human prion protein, synuclein and Tau protein are related to major protein conformational diseases. However, this scenario contrasts with the large number of unstructured proteins identified, especially in higher eukaryotes, and the fact that the solubility of these proteins is often particularly good. We have used the algorithm TANGO to compare the beta aggregation tendency of a set of globular proteins derived from SCOP and a set of 296 experimentally verified, non-redundant IDPs but also with a set of IDPs predicted by the algorithms DisEMBL and GlobPlot. Our analysis shows that the beta-aggregation propensity of all-alpha, all-beta and mixed alpha/beta globular proteins as well as membrane-associated proteins is fairly similar. This illustrates firstly that globular structures possess an appreciable amount of structural frustration and secondly that beta-aggregation is not determined by hydrophobicity and beta-sheet propensity alone. We also show that globular proteins contain almost three times as much aggregation nucleating regions as IDPs and that the formation of highly structured globular proteins comes at the cost of a higher beta-aggregation propensity because both structure and aggregation obey very similar physico-chemical constraints. Finally, we discuss the fact that although IDPs have a much lower aggregation propensity than globular proteins, this does not necessarily mean that they have a lower potential for amyloidosis.

The empirical force field Fold-X was developed previously to allow rapid free energy calculations in proteins. Here, we present an enhanced version of the force field allowing prediction of the position of structural water molecules and metal ions, together called single atom ligands. Fold-X picks up 76% of water molecules found to interact with two or more polar atoms of proteins in high-resolution crystal structures and predicts their position to within 0.8 Å on average. The prediction of metal ion-binding sites have success rates between 90% and 97% depending on the metal, with an overall standard deviation on the position of binding of 0.3-0.6 Å. The following metals were included in the force field: Mg 2+ , Ca 2+ , Zn 2+ , Mn 2+ , and Cu 2+ . As a result, the current version of Fold-X can accurately decorate a protein structure with biologically important ions and water molecules. Additionally, the free energy of binding of Ca 2+ and Zn 2+ (i.e., the natural logarithm of the dissociation constant) and its dependence on ionic strength correlate reasonably well with the experimental data available in the literature, allowing one to discriminate between high- and low-affinity binding sites. Importantly, the accuracy of the energy prediction presented here is sufficient to efficiently discriminate between Mg 2+ , Ca 2+ , and Zn 2+ binding.

Abstract Decades of research into bacterial persistence has been unable to fully characterize this antibiotic-tolerant phenotype, thereby hampering the development of therapies effective against chronic infections. Although some active persister mechanisms have been identified, the prevailing view is that cells become persistent because they enter a dormant state. We therefore characterized starvation-induced dormancy in Escherichia coli . Our findings indicate that dormancy develops gradually; persistence strongly increases during stationary phase and decreases again as persisters enter the viable but nonculturable (VBNC) state. Importantly, we show that dormancy development is tightly associated with progressive protein aggregation, which occurs concomitantly with ATP depletion during starvation. Persisters contain protein aggregates in an early developmental stage while VBNC cells carry more mature aggregates. Finally, we show that at least one persister protein, ObgE, works by triggering aggregation and thereby changing the dynamics of persistence and dormancy development. These findings provide evidence for a genetically-controlled, gradual development of persisters and VBNC cells through protein aggregation.