Abstract Watson-Crick base pairs (bps) are the fundamental unit of genetic information and the building blocks of the DNA double helix. However, A-T and G-C can also form alternative ‘Hoogsteen’ bps, expanding the functional complexity of DNA. We developed ‘Hoog-finder’, which uses structural fingerprints to rapidly screen Hoogsteen bps, which may have been mismodeled as Watson-Crick in crystal structures of protein-DNA complexes. We uncovered seventeen Hoogsteen bps, seven of which were in complex with six proteins never before shown to bind Hoogsteen bps. The Hoogsteen bps occur near mismatches, nicks, and lesions and some appear to participate in recognition and damage repair. Our results suggest a potentially broad role for Hoogsteen bps in stressed regions of the genome and call for a community-wide effort to identify these bps in current and future crystal structures of DNA and its complexes.

SUMMARY Some G protein-coupled receptor (GPCR) ligands act as “biased agonists” which preferentially activate specific signaling transducers over others. Although GPCRs are primarily found at the plasma membrane, GPCRs can traffic to and signal from many subcellular compartments. Here, we determine that differential subcellular signaling contributes to the biased signaling generated by three endogenous ligands of the chemokine GPCR CXCR3. The signaling profile of CXCR3 changed as it trafficked from the plasma membrane to endosomes in a ligand-specific manner. Endosomal signaling was critical for biased activation of G proteins, β-arrestins, and ERK1/2. In CD8+ T cells, the chemokines promoted unique transcriptional responses predicted to regulate inflammatory pathways. In a mouse model of contact hypersensitivity, β-arrestin-biased CXCR3-mediated inflammation was dependent on receptor internalization. Our work demonstrates that differential subcellular signaling is critical to the overall biased response observed at CXCR3, which has important implications for drugs targeting chemokine receptors and other GPCRs.

ABSTRACT Some G protein-coupled receptors (GPCRs) demonstrate biased signaling , where ligands of the same receptor differentially activate specific downstream signaling pathways over others. Ligand-specific receptor phosphorylation by GPCR kinases (GRKs) is one mechanism underlying this phenomenon. Recent evidence demonstrates that GPCRs traffic to and signal from subcellular compartments beyond the plasma membrane, a paradigm termed location bias . Here, we show that GRKs translocate to endosomes following stimulation of the chemokine receptor CXCR3 and other GPCRs. The GRK recruitment patterns at the plasma membrane and endosome are distinct and depend on the identity of the ligand used to activate the receptor. Using cells deficient of GRKs, we demonstrate that biased ligands have unique signaling profiles upon rescue of location-specific GRK isoforms. Our work highlights a role of the GRKs in location-biased GPCR signaling and demonstrates the complex interactions between ligand, GRK isoform and cellular location that contribute to biased signaling.

ABSTRACT The canonical paradigm of GPCR signaling recognizes G proteins and β-arrestins as the two primary transducers that promote GPCR signaling. Recent evidence suggests the atypical chemokine receptor 3 (ACKR3) does not couple to G proteins, and β-arrestins are dispensable for some of its functions. Here, we employed proximity labeling to identify proteins that interact with ACKR3 in cells devoid of β-arrestin. We identified proteins involved in the endocytic machinery and evaluated a subset of proteins conserved across several GPCR-based proximity labeling experiments. We discovered that the bone morphogenic protein 2-inducible kinase (BMP2K) interacts with many different GPCRs with varying dependency on β-arrestin. Together, our work highlights the existence of modulators that can act independently of G proteins and β-arrestins to regulate GPCR signaling and provides important evidence for other targets that may regulate GPCR signaling. Graphical Abstract

Abstract As the Watson-Crick faces of nucleobases are protected in double-stranded DNA (dsDNA), it is commonly assumed that deleterious alkylation damage to the Watson-Crick faces of nucleobases predominantly occurs when DNA becomes single-stranded during replication and transcription. However, damage to the Watson-Crick faces of nucleobases has been reported in dsDNA in vitro through mechanisms that are not understood. In addition, the extent of protection from methylation damage conferred by dsDNA relative to single-stranded DNA (ssDNA) has not been quantified. Watson-Crick base-pairs in dsDNA exist in dynamic equilibrium with Hoogsteen base-pairs that expose the Watson-Crick faces of purine nucleobases to solvent. Whether this can influence the damage susceptibility of dsDNA remains unknown. Using dot-blot and primer extension assays, we measured the susceptibility of adenine-N1 to methylation by dimethyl sulfate (DMS) when in an A-T Watson-Crick versus Hoogsteen conformation. Relative to unpaired adenines in a bulge, Watson-Crick A-T base-pairs in dsDNA only conferred ~130-fold protection against adenine-N1 methylation and this protection was reduced to ~40-fold for A( syn )-T Hoogsteen base-pairs embedded in a DNA-drug complex. Our results indicate that Watson-Crick faces of nucleobases are accessible to alkylating agents in canonical dsDNA and that Hoogsteen base-pairs increase this accessibility. Given the higher abundance of dsDNA relative to ssDNA, these results suggest that dsDNA could be a substantial source of cytotoxic damage. The work establishes DMS probing as a method for characterizing A( syn )-T Hoogsteen base pairs in vitro and also lays the foundation for a sequencing approach to map A( syn )-T Hoogsteen and unpaired adenines genome-wide in vivo .