Abstract Downregulation of the urea cycle enzyme argininosuccinate synthase (ASS1) in multiple tumors is associated with a poor prognosis partly because of the metabolic diversion of cytosolic aspartate for pyrimidine synthesis, supporting proliferation and mutagenesis owing to nucleotide imbalance. Here, we find that prolonged loss of ASS1 promotes DNA damage in colon cancer cells and fibroblasts from subjects with citrullinemia type I. Following acute induction of DNA damage with doxorubicin, ASS1 expression is elevated in the cytosol and the nucleus with at least a partial dependency on p53; ASS1 metabolically restrains cell cycle progression in the cytosol by restricting nucleotide synthesis. In the nucleus, ASS1 and ASL generate fumarate for the succination of SMARCC1, destabilizing the chromatin-remodeling complex SMARCC1–SNF5 to decrease gene transcription, specifically in a subset of the p53-regulated cell cycle genes. Thus, following DNA damage, ASS1 is part of the p53 network that pauses cell cycle progression, enabling genome maintenance and survival. Loss of ASS1 contributes to DNA damage and promotes cell cycle progression, likely contributing to cancer mutagenesis and, hence, adaptability potential.

Human NAT10 acetylates the N4 position of cytidine in RNA, predominantly on rRNA and tRNA, to facilitate ribosome biogenesis and protein translation. NAT10 has been proposed as a therapeutic target in cancers as well as aging-associated pathologies such as Hutchinson-Gilford Progeria Syndrome (HGPS). The ∼120 kDa NAT10 protein uses its acetyl-CoA-dependent acetyltransferase, ATP-dependent helicase, and RNA binding domains in concert to mediate RNA-specific N4-cytidine acetylation. While the biochemical activity of NAT10 is well known, the molecular basis for catalysis of eukaryotic RNA acetylation remains relatively undefined. To provide molecular insights into the RNA-specific acetylation by NAT10, we determined the single particle cryo-EM structures of Chaetomium thermophilum NAT10 ( Ct NAT10) bound to a bisubstrate cytidine-CoA probe with and without ADP. The structures reveal that NAT10 forms a symmetrical heart-shaped dimer with conserved functional domains surrounding the acetyltransferase active sites harboring the cytidine-CoA probe. Structure-based mutagenesis with analysis of mutants in vitro supports the catalytic role of two conserved active site residues (His548 and Tyr549 in Ct NAT10), and two basic patches, both proximal and distal to the active site for RNA-specific acetylation. Yeast complementation analyses and senescence assays in human cells also implicates NAT10 catalytic activity in yeast thermoadaptation and cellular senescence. Comparison of the NAT10 structure to protein lysine and N-terminal acetyltransferase enzymes reveals an unusually open active site suggesting that these enzymes have been evolutionarily tailored for RNA recognition and cytidine-specific acetylation.

Abstract The transcriptional coactivators EP300 and CREBBP are critical regulators of gene expression that share high sequence identity but exhibit non-redundant functions in basal and pathological contexts. Here, we report the development of a bifunctional small molecule, MC-1, capable of selectively degrading EP300 over CREBBP. Using a potent aminopyridine-based inhibitor of the EP300/CREBBP catalytic domain in combination with a VHL ligand, we demonstrate that MC-1 preferentially degrades EP300 in a proteasome-dependent manner. Mechanistic studies reveal that selective degradation cannot be predicted solely by target engagement or ternary complex formation, suggesting additional factors govern paralogue-specific degradation. MC-1 inhibits cell proliferation in a subset of cancer cell lines and provides a new tool to investigate the non-catalytic functions of EP300 and CREBBP. Our findings expand the repertoire of EP300/CREBBP-targeting chemical probes and offer insights into the determinants of selective degradation of highly homologous proteins.

ABSTRACT Metabolic reprogramming is a hallmark of cancer that facilitates changes in many adaptive biological processes. Mutations in the tricarboxylic acid (TCA) cycle enzyme fumarate hydratase (FH) lead to fumarate accumulation and cause hereditary leiomyomatosis and renal cell cancer (HLRCC). HLRCC is a rare, inherited disease characterized by the development of non-cancerous smooth muscle tumors of the uterus and skin, and an increased risk of a highly metastatic and aggressive form of kidney cancer. Fumarate has been shown to inhibit 2-oxyglutarate-dependent dioxygenases (2OGDDs) involved in the hydroxylation of HIF1α, as well as in DNA and histone demethylation. However, the link between fumarate accumulation and changes in RNA post-transcriptional modifications has not been defined. Here, we determine the consequences of fumarate accumulation on the activity of different members of the 2OGDD family targeting RNA modifications. By evaluating multiple RNA modifications in patient-derived HLRCC cell lines, we show that mutation of FH selectively alters the activity of demethylases acting upon N6-methyladenosine (m 6 A), while the demethylase acting upon N1-methyladenosine (m 1 A) and 5-formylcytosine (f 5 C) in mitochondrial RNA are unaffected. The observation that metabolites modulate specific subsets of RNA-modifying enzymes offers new insights into the intersection between metabolism and the epitranscriptome.

The human acetyltransferase paralogs EP300 and CREBBP are master regulators of lysine acetylation whose activity has been implicated in various cancers. In the half-decade since the first drug-like inhibitors of these proteins were reported, three unique molecular scaffolds have taken precedent: an indane spiro-oxazolidinedione (A-485), a spiro-hydantoin (iP300w), and an aminopyridine (CPI-1612). Despite increasing use of these molecules to study lysine acetylation, the dearth of data regarding their relative biochemical and biological potencies makes their application as chemical probes a challenge. To address this gap, here we present a comparative study of drug-like EP300/CREBBP acetyltransferase inhibitors. First, we determine the biochemical and biological potencies of A-485, iP300w, and CPI-1612, highlighting the increased potency of the latter two compounds at physiological acetyl-CoA concentrations. Cellular evaluation shows that inhibition of histone acetylation and cell growth closely aligns with the biochemical potencies of these molecules, consistent with an on-target mechanism. Finally, we demonstrate the utility of comparative pharmacology by using it to investigate the hypothesis that increased CoA synthesis caused by knockout of PANK4 can competitively antagonize binding of EP300/CREBBP inhibitors and demonstrate proof-of-concept photorelease of a potent inhibitor molecule. Overall, our study demonstrates how knowledge of relative inhibitor potency can guide the study of EP300/CREBBP-dependent mechanisms and suggests new approaches to target delivery, thus broadening the therapeutic window of these preclinical epigenetic drug candidates.

Hereditary cancer disorders often provide an important window into novel mechanisms supporting tumor growth and survival. Understanding these mechanisms and developing biomarkers to identify their presence thus represents a vital goal. Towards this goal, here we report a chemoproteomic map of the covalent targets of fumarate, an oncometabolite whose accumulation marks the genetic cancer predisposition syndrome hereditary leiomyomatosis and renal cell carcinoma (HLRCC). First, we validate the ability of known and novel chemoproteomic probes to report on concentration-dependent fumarate reactivity in vitro. Next, we apply these probes in concert with LC-MS/MS to identify cysteine residues sensitive to either fumarate treatment or fumarate hydratase (FH) mutation in untransformed and HLRCC cell models, respectively. Mining this data to understand the structural determinants of fumarate reactivity led to the discovery of an unexpected anti-correlation with nucleophilicity, indicating a novel influence of pH on fumarate-cysteine interactions. Finally, we show that many fumarate-sensitive and FH-regulated cysteines are found in functional protein domains, and perform functional studies of a fumarate-sensitive cysteine in SMARCC1 that lies at a key protein-protein interface in the SWI-SNF tumor suppressor complex. Our studies provide a powerful resource for understanding the influence of fumarate on reactive cysteine residues, and lay the foundation for future efforts to exploit this distinct aspect of oncometabolism for cancer diagnosis and therapy.

Anabolic metabolism of carbon in mammals is mediated via the one and two carbon carriers S-adenosyl methionine and acetyl-coenzyme A (acetyl-CoA). In contrast, anabolic metabolism using three carbon units via propionyl-CoA is not thought to occur. Mammals are primarily thought to oxidize 3-carbon units by shunting propionyl-CoA to succinyl-CoA for entry into the TCA cycle. We found that this may not be absolute and that in mammals one non-oxidative fate of two units of propionyl-CoA is to condense to a six-carbon trans-2-methyl-2-pentenoyl-CoA (2M2PE-CoA). Using ex vivo isotope tracing, we found that 2M2PE-CoA formed in human myocardial tissue incubated with propionate. In whole-body in vivo stable isotope tracing with infusion of 13C-labeled valine achieving steady state, 2M2PE-CoA formed via propionyl-CoA in multiple murine tissues including heart, kidney, and to a lesser degree in brown adipose tissue, liver, and tibialis anterior muscle. These results confirm the in vivo existence of at least one anabolic three to six carbon reaction conserved in humans and mice that utilizes three carbons via propionate.

Short chain fatty acids (SCFAs) play a central role in health and disease. One function of these signaling molecules is to serve as precursors for short chain fatty acylation, a class of metabolically-derived posttranslational modifications (PTMs) that are established by lysine acetyltransferases (KATs) and lysine deacetylases (KDACs). Via this mechanism, short chain fatty acylation serves as an integrated reporter of metabolism as well as KAT and KDAC activity, and has the potential to illuminate the role of these processes in disease. However, few methods to study short chain fatty acylation exist. Here we report a bioorthogonal pro-metabolite strategy for profiling short chain fatty acylation in living cells. Inspired by the dietary component tributyrin, we synthesized a panel of ester-caged bioorthogonal short chain fatty acids. Cellular evaluation of these agents led to the discovery of an azido-ester that is metabolized to its cognate acyl-coenzyme A (CoA) and affords robust protein labeling profiles. We comprehensively characterize the metabolic dependence, toxicity, and histone deacetylase (HDAC) inhibitory activity of these bioorthogonal pro-metabolites, and apply an optimized probe to identify novel candidate protein targets of short chain fatty acids in cells. Our studies showcase the utility of bioorthogonal pro-metabolites for unbiased profiling of cellular protein acylation, and suggest new approaches for studying the signaling functions of SCFAs in differentiation and disease.

Lysine acetyltransferases (KATs) play a critical role in the regulation of transcription and other genomic functions. However, a persistent challenge is the development of assays capable of defining KAT activity directly in living cells. Towards this goal, here we report the application of a previously reported dCas9-p300 fusion as a transcriptional reporter of KAT activity. First we benchmark the activity of dCas9-p300 relative to other dCas9-based transcriptional activators, and demonstrate its compatibility with second generation short guide RNA architectures. Next, we repurpose this technology to rapidly identify small molecule inhibitors of acetylation-dependent gene expression. These studies validate a recently reported p300 inhibitor chemotype, and reveal a role for p300s bromodomain in dCas9-p300-mediated transcriptional activation. Comparison with other CRISPR-Cas9 transcriptional activators highlights the inherent ligand tuneable nature of dCas9-p300 fusions, suggesting new opportunities for orthogonal gene expression control. Overall, our studies highlight dCas9-p300 as a powerful tool for studying gene expression mechanisms in which acetylation plays a causal role, and provide a foundation for future applications requiring spatiotemporal control over acetylation at specific genomic loci.

Abstract Acetylation of protein and RNA represent a critical event for development and cancer progression. NAT10 is the only known RNA acetylase that catalyzes the N4-actylcytidine (ac4C) modification of RNAs. Here, we show that the loss of NAT10 significantly decreases lung metastasis in allograft and genetically engineered mouse models of breast cancer. NAT10 interacts with a mechanosensitive, metastasis susceptibility protein complex at the nuclear pore. In addition to its canonical role in RNA acetylation, we find that NAT10 interacts with p300 at gene enhancers. NAT10 loss is associated with p300 mislocalization into heterochromatin regions. NAT10 depletion disrupts enhancer organization, leading to alteration of gene transcription necessary for metastatic progression, including reduced myeloid cell-recruiting chemokines that results in a less metastasis-prone tumor microenvironment. Our study uncovers a distinct role of NAT10 in enhancer organization of metastatic tumor cells and suggests its involvement in the tumor-immune crosstalk dictating metastatic outcomes.