Abstract KIF1A is a highly processive vesicle transport motor in the kinesin-3 family. Mutations in KIF1A lead to neurodegenerative diseases including hereditary spastic paraplegia. We applied optical tweezers to study the ability of KIF1A to generate and sustain force against hindering loads. We used both the three-bead assay, where force is oriented parallel to the microtubule, and the traditional single-bead assay, where force is directed along the radius of the bead, resulting in a vertical force component. The average force and attachment duration of KIF1A in the three-bead assay were substantially greater than those observed in the single-bead assay. Thus, vertical forces accelerate termination of force ramps of KIF1A. Average KIF1A termination forces were slightly lower than the kinesin-1 KIF5B, and the median attachment duration of KIF1A was >10-fold shorter than KIF5B under hindering loads. KIF1A rapidly reengages with microtubules after detachment, as observed previously. Strikingly, quantification enabled by the three-bead assay shows that reengagement largely occurs within 2 ms of detachment, indicating that KIF1A has a nearly tenfold faster reengagement rate than KIF5B. We found that rapid microtubule reengagement is not due to KIF1A’s positively charged loop-12; however, removal of charge from this loop diminished the unloaded run length at near physiological ionic strength. Both loop-12 and the microtubule nucleotide state have modulatory effects on reengagement under load, suggesting a role for the microtubule lattice in KIF1A reengagement. Our results reveal adaptations of KIF1A that lead to a novel model of super-engaging transport under load.

Kinesin-based cargo transport in cells frequently involves the coordinated activity of multiple motors, including kinesins from different families that move at different speeds. However, compared to the progress at the single-molecule level, mechanisms by which multiple kinesins coordinate their activity during cargo transport are poorly understood. To understand these multi-motor coordination mechanisms, defined pairs of kinesin-1 and kinesin-2 motors were assembled on DNA scaffolds and their motility examined in vitro. Although less processive than kinesin-1 at the single-molecule level, addition of kinesin-2 motors more effectively amplified cargo run lengths. By applying the law of total expectation to cargo binding durations in ADP, the kinesin-2 microtubule reattachment rate was shown to be 4-fold faster than that of kinesin-1. This difference in microtubule binding rates was also observed in solution by stopped-flow. High-resolution tracking of gold-nanoparticle-labeled cargo with 1 ms and 2 nm precision revealed that kinesin-2 motors detach and rebind to the microtubule much more frequently than do kinesin-1. Finally, cargo transported by kinesin-2 motors more effectively navigated roadblocks on the microtubule track. These results highlight the importance of motor reattachment kinetics during multi-motor transport and suggest a coordinated transport model in which kinesin-1 motors step effectively against loads while kinesin-2 motors rapidly unbind and rebind to the microtubule. This dynamic tethering by kinesin-2 maintains the cargo near the microtubule and enables effective navigation along crowded microtubules.

Abstract Efficient cellulose degradation by cellulase enzymes is crucial for using lignocellulosic biomass in bioenergy production. In the cell wall of plants, cellulose is bound by lignin and hemicellulose, which are key factors contributing to the recalcitrance of plant biomass. These non-cellulosic cell wall components are known to interfere with the function of cellulolytic enzymes. While the effects of lignin have been studied extensively, the contribution of xylan, the major hemicellulose in the secondary cell walls of plants, is often overlooked. To study those effects, we generated model cell wall composites by growing bacterial cellulose supplemented with varying concentrations of purified xylan. We used single-molecule microscopy to image and track fluorescently labeled Tr Cel7A, a commonly used model cellulase, as it binds and hydrolyses cellulose in these synthetic composites. We found that minute amounts of xylan are sufficient to significantly inhibit the binding of Cel7A to cellulose. The inclusion of xylan also reduced considerably the proportion of moving enzyme molecules, without affecting their velocity and run length. We suggest that, when available at low concentrations, xylan thinly coats cellulose fibrils, and incorporates as continuous patches when available at higher concentrations. Non-productive binding of Cel7A to xylan was not found to be a major inhibition mechanism. Our results highlight the importance of targeting xylan removal during biomass processing and demonstrate the potential of using single-molecule imagining to study the activity and limitations of cellulolytic enzymes. Graphical abstract

The human genome encodes 45 kinesins that drive cell division, cell motility, intracellular trafficking, and ciliary function. Determining the cellular function of each kinesin would be greatly facilitated by specific small molecule inhibitors, but screens have yielded inhibitors that are specific to only a small number of kinesins, likely due to the high conservation of the kinesin motor domain across the superfamily. Here we present a chemical-genetic approach to engineer kinesin motors that retain microtubule-dependent motility in the absence of inhibitor yet can be efficiently inhibited by small, cell-permeable molecules. Using kinesin-1 as a prototype, we tested two independent strategies to design inhibitable motors. First, we inserted the six amino acid tetracysteine tag into surface loops of the motor domain such that binding of biarsenic dyes allosterically inhibits processive motility. Second, we fused DmrB dimerization domains to the motor heads such that addition of B/B homodimerizer cross-links the two motor domains and inhibits motor stepping. We show, using cellular assays that the engineered kinesin-1 motors are able to transport artificial and natural kinesin-1 cargoes, but are efficiently inhibited by the addition of the relevant small molecule. Single-molecule imaging in vitro revealed that inhibitor addition reduces the number of processively moving motors on the microtubule, with minor effects on motor run length and velocity. It is likely that these inhibition strategies can be successfully applied to other members of the kinesin superfamily due to the high conservation of the kinesin motor domain. The described engineered motors will be of great utility to dynamically and specifically study kinesin function in cells and animals.

PAKRP2 is an orphan kinesin in Arabidopsis thaliana that is thought to transport vesicles along phragmoplast microtubules for cell plate formation. Here, using single-molecule fluorescence microscopy, we show that PAKRP2 exhibits processive plus-end-directed motility on single microtubules as individual homodimers despite having an exceptionally long (32 residues) neck linker. Furthermore, using high-resolution nanoparticle tracking to visualize motor stepping dynamics, we find that PAKRP2 achieves processivity via a noncanonical stepping mechanism that includes small step sizes and frequent lateral steps to adjacent protofilaments. We propose that the small steps sizes are due to a transient intermediate step that involves a prolonged diffusional search of the tethered head due to its long neck linker. Despite this different stepping behavior, ATP is tightly coupled to each 8-nm step. Collectively, this study reveals PAKRP2 as the first orphan kinesin to demonstrate processive motility and broadens our understanding of the diverse kinesin stepping mechanisms.

Abstract Bidirectional vesicle transport along microtubules is necessary for cell viability and function, particularly in neurons. When multiple motors are attached to a vesicle, the distance a vesicle travels before dissociating is determined by the race between detachment of the bound motors and attachment of the unbound motors. Motor detachment rate constants (k off ) can be measured via single-molecule experiments, but motor reattachment rate constants (k on ) are generally unknown, as they involve diffusion through the bilayer, geometrical considerations of the motor tether length, and the intrinsic microtubule binding rate of the motor. To understand motor attachment dynamics during vesicle transport, we quantified the microtubule accumulation rate of fluorescently-labeled kinesin-1 motors in a 2D system where motors were linked to a supported lipid bilayer. From the first-order accumulation rate at varying motor densities, we extrapolated a k off that matched single-molecule measurements, and measured a two-dimensional k on for membrane-bound kinesin-1 motors binding to the microtubule. This k on is consistent with kinesin-1 being able to reach roughly 20 tubulin subunits when attaching to a microtubule. By incorporating cholesterol to reduce membrane diffusivity, we demonstrate that this k on is not limited by the motor diffusion rate, but instead is determined by the intrinsic motor binding rate. For intracellular vesicle trafficking, this two-dimensional k on predicts that long-range transport of 100 nm diameter vesicles requires 35 kinesin-1 motors, suggesting that teamwork between different motor classes and motor clustering may play significant roles in long-range vesicle transport. Significance Statement Long-distance transport of membrane-coated vesicles involves coordination of multiple motors such that at least one motor is bound to the microtubule at all times. Microtubule attachment of a membrane-bound motor comprises two steps – diffusing through the lipid bilayer to a binding zone near the microtubule, followed by binding. Using a 2D supported lipid bilayer system, we show that membrane diffusion is not the limiting factor for motor attachment. This result suggests that in cells kinesin-1 binding kinetics are not altered by the membrane composition of vesicle cargos. The intrinsically slow binding properties of kinesin-1 suggest that divergent motor binding kinetics and motor clustering regulate long-range vesicle transport.

The construction and function of virtually all cilia require the universally conserved process of Intraflagellar Transport (IFT). During the atypically fast IFT in the green alga C. reinhardtii, up to ten kinesin-2 motors line up in a tight assembly on the trains, provoking the question of how these motors coordinate their action to ensure smooth and fast transport along the flagellum without standing in each others way. Here, we show that the heterodimeric FLA8/10 kinesin-2 alone is responsible for the atypically fast IFT in C. reinhardtii. Notably, in single-molecule studies, FLA8/10 moved at speeds matching those of in vivo IFT, but additionally displayed a slow velocity distribution, indicative of auto-inhibition. Addition of the KAP subunit to generate the heterotrimeric FLA8/10/KAP relieved this inhibition, thus providing a mechanistic rationale for heterotrimerization with the KAP subunit in fully activating FLA8/10 for IFT in vivo. Finally, we link fast FLA8/10 and slow KLP11/20 kinesin-2 from C. reinhardtii and C. elegans through a DNA tether to understand the molecular underpinnings of motor coordination during IFT in vivo. For motor pairs from both species, the co-transport velocities very nearly matched the single-molecule velocities, and the complexes both spent roughly 80% of the time with only one of the two motors attached to the microtubule. Thus, irrespective of phylogeny and kinetic properties, kinesin-2 motors prefer to work alone without sacrificing efficiency. Our findings thus offer a simple mechanism for how efficient IFT is achieved across diverse organisms despite being carried out by motors with different properties.