Abstract CRISPR knockout screens have accelerated the discovery of important cancer genetic dependencies. However, traditional CRISPR-Cas9 screens are limited in their ability to assay the function of redundant or duplicated genes. Paralogs in multi-gene families constitute two-thirds of the protein-coding genome, so this blind spot is the rule, not the exception. To overcome the limitations of single gene CRISPR knockout screens, we developed p aired g uide RNAs for P aralog g EN etic interaction mapping (pgPEN), a pooled CRISPR/Cas9 approach which targets over a thousand duplicated human paralogs in single knockout and double knockout configurations. We applied pgPEN to two cell lineages and discovered that over 10% of human paralogs exhibit synthetic lethality in at least one cellular context. We recovered known synthetic lethal paralogs such as MAP2K1/MAP2K2 , important drug targets such as CDK4/CDK6 , and numerous other synthetic lethal pairs such as CCNL1/CCNL2. In addition, we identified ten tumor suppressive paralog pairs whose compound loss promotes cell growth. These findings identify a large number of previously unidentified essential gene families and nominate new druggable targets for oncology drug discovery. Highlights Comprehensive genetic interaction mapping of 1,030 human duplicated paralogs using a dual targeting CRISPR/Cas9 approach Duplicated paralogs are highly enriched for genetic interactions Synthetic lethal paralogs include CCNL1/CCNL2, CDK4/CDK6 , and GSK3A/GSK3B Tumor suppressor paralog pairs include CDKN2A/CDKN2B and FBXO25/FBXO32

Abstract Objective We previously reported that high expression of the extracellular glutathione peroxidase GPX3 is associated with poor patient outcome in ovarian serous adenocarcinomas, and that GPX3 protects ovarian cancer cells from oxidative stress in culture. Here we tested if GPX3 is necessary for tumor establishment in vivo and to identify novel downstream mediators of GPX3’s pro-tumorigenic function. Methods GPX3 was knocked-down in ID8 ovarian cancer cells by shRNA to test the role of GPX3 in tumor establishment using a syngeneic IP xenograft model. RNA sequencing analysis was carried out in OVCAR3 cells following shRNA-mediated GPX3 knock-down to identify GPX3-dependent gene expression signatures. Results GPX3 knock-down abrogated clonogenicity and intraperitoneal tumor development in vivo , and the effects were dependent on the level of GPX3 knock-down. RNA sequencing showed that loss of GPX3 leads to decreased gene expression patterns related to pro-tumorigenic signaling pathways. Validation studies identified GDF15 as strongly dependent on GPX3. GDF15, a member of the TGF-β growth factor family, has known oncogenic and immune modulatory activities. Similarly, GPX3 expression positively correlated with pro-tumor immune cell signatures, including regulatory T-cell and macrophage infiltration, and displayed significant correlation with PD-L1 expression. Conclusions We show for the first time that tumor produced GPX3 is necessary for ovarian cancer growth in vivo and that it regulates expression of GDF15. The immune profile associated with GPX3 expression in serous ovarian tumors suggests that GPX3 may be an alternate marker of ovarian tumors susceptible to immune check-point inhibitors.

Aberrant mitochondrial fission/fusion dynamics have previously been reported in cancer cells. While post translational modifications are known regulators of GTPases of the mitochondrial fission/fusion machinery, we show for the first time that alternate splice variants of the fission protein Drp1 (DNM1L) have specific and unique roles in ovarian cancer, adding to the complexity of mitochondrial fission/fusion regulation in tumor cells. We find that ovarian cancer specimens express a Drp1 alternate splice transcript variant lacking exon 16 of the variable domain. High expression of Drp1 lacking exon 16 relative to other transcripts is associated with poor patient outcome. Unlike the full length variant, expression of Drp1 lacking exon 16 leads to decreased association of Drp1 to mitochondrial fission sites, more fused mitochondrial networks, enhanced respiration and TCA cycle metabolites, and is associated with a more tumorigenic phenotype. These effects can also be reversed by specific siRNA-mediated inhibition of the endogenously expressed transcript lacking exon 16. Moreover, lack of exon 16 abrogates mitochondrial fission in response to pro-apoptotic stimuli and leads to decreased sensitivity to chemotherapeutics. These data emphasize the significance of the pathophysiological consequences of Drp1 alternate splicing and divergent functions of Drp1 splice variants, and strongly warrant consideration of Drp1 splicing in future studies.