Abstract Motivation: The sequence alignment/map (SAM) and the binary alignment/map (BAM) formats have become the standard method of representation of nucleotide sequence alignments for next-generation sequencing data. SAM/BAM files usually contain information from tens to hundreds of millions of reads. Often, the sequencing technology, protocol and/or the selected mapping algorithm introduce some unwanted biases in these data. The systematic detection of such biases is a non-trivial task that is crucial to drive appropriate downstream analyses. Results: We have developed Qualimap, a Java application that supports user-friendly quality control of mapping data, by considering sequence features and their genomic properties. Qualimap takes sequence alignment data and provides graphical and statistical analyses for the evaluation of data. Such quality-control data are vital for highlighting problems in the sequencing and/or mapping processes, which must be addressed prior to further analyses. Availability: Qualimap is freely available from http://www.qualimap.org. Contact: aconesa@cipf.es Supplementary Information: Supplementary data are available at Bioinformatics online.

Two genome-wide RNA interference screens published in this issue identify human host factors required for influenza A virus replication in lung epithelia cell lines. König et al. identify 295 host genes required for influenza replication. Of those, 219 are required for efficient wild-type virus growth, and 23 are required for viral entry. Karlas et al. report the discovery of 287 host genes influencing virus replication. An independent assay confirmed 168 hits (59%) inhibiting either the endemic H1N1 (119 hits) or the current pandemic swine-origin (121 hits) influenza A virus strains, with an overlap of 60%. These studies should provide a number of potential targets for host factor-directed antivirals for treatment of influenza viral infection. High mutation rates in the influenza A virus facilitate the generation of viral escape mutants, rendering vaccines and drugs potentially ineffective, but targeting host cell determinants could prevent viral escape. Here, 287 human host cell genes influencing influenza A virus replication are found using a genome-wide RNA interference screen. An independent assay is then used to investigate overlap between genes necessary for different viral strains. Influenza A virus, being responsible for seasonal epidemics and reoccurring pandemics, represents a worldwide threat to public health1. High mutation rates facilitate the generation of viral escape mutants, rendering vaccines and drugs directed against virus-encoded targets potentially ineffective2. In contrast, targeting host cell determinants temporarily dispensable for the host but crucial for virus replication could prevent viral escape. Here we report the discovery of 287 human host cell genes influencing influenza A virus replication in a genome-wide RNA interference (RNAi) screen. Using an independent assay we confirmed 168 hits (59%) inhibiting either the endemic H1N1 (119 hits) or the current pandemic swine-origin (121 hits) influenza A virus strains, with an overlap of 60%. Notably, a subset of these common hits was also essential for replication of a highly pathogenic avian H5N1 strain. In-depth analyses of several factors provided insights into their infection stage relevance. Notably, SON DNA binding protein (SON)3 was found to be important for normal trafficking of influenza virions to late endosomes early in infection. We also show that a small molecule inhibitor of CDC-like kinase 1 (CLK1)4 reduces influenza virus replication by more than two orders of magnitude, an effect connected with impaired splicing of the viral M2 messenger RNA. Furthermore, influenza-virus-infected p27-/- (cyclin-dependent kinase inhibitor 1B; Cdkn1b) mice accumulated significantly lower viral titres in the lung, providing in vivo evidence for the importance of this gene. Thus, our results highlight the potency of genome-wide RNAi screening for the dissection of virus–host interactions and the identification of drug targets for a broad range of influenza viruses.

The chromosome of N. gonorrhoeae contains several complete expression genes coding for variant opacity proteins. DNA sequence analysis of two opacity genes derived from the same locus (opaE1) of two isogenic gonococcal variants reveals common and variable regions in these genes. Genomic blotting experiments using synthetic probes suggest gene conversion as a principle for the assembly of variant sequence information in opacity genes. The 5′ region of opacity genes is composed of identical pentameric pyrimidine units (CTCTT) encoding the hydrophobic portion of the opacity leader peptide. This coding repeat is variable in a given locus with respect of the number of pentameric units. While all expression loci in a single cell are constitutively transcribed, the production of opacity proteins is determined by the coding repeat sequence on the translational level.

The gastric pathogen Helicobacter pylori uses a type IV secretion system to inject the bacterial CagA protein into gastric epithelial cells. Within the host cell, CagA becomes phosphorylated on tyrosine residues and initiates cytoskeletal rearrangements. We demonstrate here that Src-like protein-tyrosine kinases mediate CagA phosphorylation in vitro and in vivo. First, the Src-specific tyrosine kinase inhibitor PP2 specifically blocks CagA phosphorylation and cytoskeletal rearrangements thereby inhibiting the CagA-induced hummingbird phenotype of gastric epithelial cells. Second, CagA is in vivo phosphorylated by transiently expressed c-Src. Third, recombinant c-Src and lysates derived from c-Src-expressing fibroblasts but not lysates derived from Src-, Yes-, and Fyn-deficient cells phosphorylated CagA in vitro. Fourth, a transfected CagA-GFP fusion protein is phosphorylated in vivo in Src-positive fibroblasts but not in Src-, Yes-, and Fyn-deficient cells. Because a CagA-GFP fusion protein mutated in an EPIYA motif is not efficiently phosphorylated in any of these fibroblast cells, the CagA EPIYA motif appears to constitute the major c-Src phosphorylation site conserved among CagA-positiveHelicobacter strains. The gastric pathogen Helicobacter pylori uses a type IV secretion system to inject the bacterial CagA protein into gastric epithelial cells. Within the host cell, CagA becomes phosphorylated on tyrosine residues and initiates cytoskeletal rearrangements. We demonstrate here that Src-like protein-tyrosine kinases mediate CagA phosphorylation in vitro and in vivo. First, the Src-specific tyrosine kinase inhibitor PP2 specifically blocks CagA phosphorylation and cytoskeletal rearrangements thereby inhibiting the CagA-induced hummingbird phenotype of gastric epithelial cells. Second, CagA is in vivo phosphorylated by transiently expressed c-Src. Third, recombinant c-Src and lysates derived from c-Src-expressing fibroblasts but not lysates derived from Src-, Yes-, and Fyn-deficient cells phosphorylated CagA in vitro. Fourth, a transfected CagA-GFP fusion protein is phosphorylated in vivo in Src-positive fibroblasts but not in Src-, Yes-, and Fyn-deficient cells. Because a CagA-GFP fusion protein mutated in an EPIYA motif is not efficiently phosphorylated in any of these fibroblast cells, the CagA EPIYA motif appears to constitute the major c-Src phosphorylation site conserved among CagA-positiveHelicobacter strains. Helicobacter pylori is a highly successful bacterial pathogen of the human stomach. Infection typically leads to a state of chronic inflammation that is frequently associated with diseases like chronic gastritis, peptic ulceration, and sometimes mucosa-associated lymphoid tissue lymphoma and adenocarcinoma of the stomach (1Cover T.L. Blaser M.J. Gastroenterology. 1999; 117: 257-261Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (60) Google Scholar). Among several virulence determinants the H. pyloricytotoxin-associated pathogenicity island (cagPAI) 1cagPAIcytotoxin-associated pathogenicity islandGFPgreen fluorescent proteinPTKprotein-tyrosine kinaseEGFRepidermal growth factor receptor has gained special interest (2Montecucco C. Rappuoli R. Nat. Rev. Mol. Cell. Biol. 2000; 2: 457-466Crossref Scopus (435) Google Scholar). Strains carrying cagPAI are generally more virulent than strains lacking the island, which often resemble commensal bacteria more than pathogens. Whereas the function of most of the cagPAI genes is unknown, some share significant homology to virB and virD genes known from other Gram-negative pathogens like Agrobacterium tumefaciens and Bordetella pertussis (3Covacci A. Telford J.L. Del Giudice G. Parsonnet J. Rappuoli R. Science. 1999; 284: 1328-1333Crossref PubMed Scopus (957) Google Scholar). These genes encode components of so-called type IV secretion systems that can be regarded as molecular syringes injecting bacterial effector molecules into the cytoplasm of host cells. H. pylori has been shown to possess a functional type IV secretion system that transfers the bacterial CagA protein into gastric epithelial cells where it becomes tyrosine-phosphorylated (4Segal E.D. Cha J., Lo, J. Falkow S. Tompkins L.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 14559-14564Crossref PubMed Scopus (672) Google Scholar, 5Asahi M. Azuma T. Ito S. Ito Y. Suto H. Nagai Y. Tsubokawa M. Tohyama Y. Maeda S. Omata M. Suzuki T. Sasakawa C. J. Exp. Med. 2000; 191: 593-602Crossref PubMed Scopus (426) Google Scholar, 6Stein M. Rappuoli R. Covacci A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 1263-1268Crossref PubMed Scopus (520) Google Scholar, 7Odenbreit S. Püls J. Sedlmaier B. Gerland E. Fischer W. Haas R. Science. 2000; 287: 1497-1500Crossref PubMed Scopus (1083) Google Scholar, 8Backert S. Ziska E. Brinkmann V. Zimny-Arndt U. Fauconnier A. Jungblut P.R. Naumann M. Meyer T.F. Cell. Microbiol. 2000; 2: 155-164Crossref PubMed Scopus (371) Google Scholar). The H. pylori type IV secretion system is also implicated in the induction of proinflammatory cytokines (9Censini S. Lange C. Xiang Z. Crabtree J.E. Ghiara P. Borodovsky M. Rappuoli R. Covacci A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1996; 93: 14648-14653Crossref PubMed Scopus (1659) Google Scholar, 10Crabtree J.E. Kersulyte D., Li, S.D. Lindley I.J. Berg D.E. J. Clin. Pathol. 1999; 52: 653-657Crossref PubMed Scopus (66) Google Scholar, 11Fischer W. Püls J. Buhrdorf R. Gebert B. Odenbreit S. Haas R. Mol. Microbiol. 2001; 42: 1337-1348Crossref PubMed Scopus (431) Google Scholar, 12Selbach M. Moese S. Meyer T.F. Backert S. Infect. Immun. 2002; 70: 665-671Crossref PubMed Scopus (129) Google Scholar). cytotoxin-associated pathogenicity island green fluorescent protein protein-tyrosine kinase epidermal growth factor receptor CagA translocation and phosphorylation has been reported to induce rearrangements of the host cell actin cytoskeleton leading to an altered cell morphology, the so-called hummingbird or scattering phenotype (4Segal E.D. Cha J., Lo, J. Falkow S. Tompkins L.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 14559-14564Crossref PubMed Scopus (672) Google Scholar, 13Backert S. Moese S. Selbach M. Brinkmann V. Meyer T.F. Mol. Microbiol. 2001; 42: 631-644Crossref PubMed Scopus (206) Google Scholar). The relevance of CagA tyrosine phosphorylation has been explored by site-directed mutagenesis. Bacteria carrying acagA gene where tyrosine residue 972 (Tyr-972) of the C-terminal EPIYA repeat has been replaced by phenylalanine are unable to rearrange the host cell cytoskeleton (13Backert S. Moese S. Selbach M. Brinkmann V. Meyer T.F. Mol. Microbiol. 2001; 42: 631-644Crossref PubMed Scopus (206) Google Scholar). This indicated that phosphorylation of the CagA EPIYA motif might be critical for signaling to the actin cytoskeleton. Indeed, recent investigations have demonstrated that the cytoplasmic tyrosine phosphatase Shp-2 is specifically recruited to tyrosine-phosphorylated CagA and is involved in downstream signaling (14Higashi, H., Tsutsumi, R., Muto, S., Sugiyama, T., Azuma, T., Asaka, M., and Hatakeyama, M. (2001) Science10-1126/Science.106747Google Scholar). However, the eukaryotic tyrosine kinase that mediates the initial phosphorylation of CagA has remained enigmatic. Here we show that members of the Src family are cellular CagA kinases both in vitro and in vivo. Recombinant c-Src is able to phosphorylate CagA in vitro. Moreover, specific pharmacological inhibition as well as genetic deletion of Src kinases inhibit the tyrosine phosphorylation of CagA in human fibroblast cells, whereas re-expression of c-Src in a Src-deficient cell re-establishes CagA tyrosine phosphorylation. Sequence analysis suggests that during the co-evolution of humans andH. pylori the CagA protein has evolved as a specific Src kinase substrate. H. pyloristrain P1 is a clinical isolate, and an isogenic ΔcagAknockout mutant was constructed (8Backert S. Ziska E. Brinkmann V. Zimny-Arndt U. Fauconnier A. Jungblut P.R. Naumann M. Meyer T.F. Cell. Microbiol. 2000; 2: 155-164Crossref PubMed Scopus (371) Google Scholar). Cultivation of H. pylori was on horse serum agar plates under microairophilic conditions according to a standard procedure (8Backert S. Ziska E. Brinkmann V. Zimny-Arndt U. Fauconnier A. Jungblut P.R. Naumann M. Meyer T.F. Cell. Microbiol. 2000; 2: 155-164Crossref PubMed Scopus (371) Google Scholar). AGS cells (ATCC CRL 1739, a human gastric adenocarcinoma epithelial cell line) were cultivated in 6-well tissue culture dishes using RPMI 1640 medium (Invitrogen) supplemented with 10% heat-inactivated fetal bovine serum (Invitrogen) for 2 days to reach monolayers of about 70% confluence. SYF cells were derived from c-src −/−, c-yes −/−, and c-fyn −/− triple knockout mouse embryos and SYF+c-src cells were obtained by stable transfection of SYF cells with mouse c-src (15Klinghoffer R.A. Sachsenmaier C. Cooper J.A. Soriano P. EMBO J. 1999; 18: 2459-2471Crossref PubMed Scopus (647) Google Scholar). Both cell lines as well as NIH 3T3 cells were grown in tissue culture flasks in Dulbecco's modified Eagle's medium (PAA Laboratories, Linz, Austria) supplemented with 10% fetal bovine serum and 1% non-essential amino acids. The tyrosine kinase inhibitors AG-370 (Biomol, Plymouth Meeting, PA), AG-1478, and PP2 (Calbiochem, San Diego, CA) were dissolved in Me2SO and added to the cells immediately before infection. Controls were performed with Me2SO alone. H. pylori were suspended in phosphate-buffered saline and added to AGS cells at a multiplicity of infection (MOI) of 100. After incubation for 5 h the cells were harvested in ice-cold phosphate-buffered saline containing 1 mm Na3VO4 (Sigma-Aldrich). H. pylori(A 550 = 0.9) were harvested in ice-cold kinase buffer (25 mm Hepes pH 7.0, 150 mm NaCl, 10 mm MgCl2, 1% Nonidet P-40, 5 mmdithiothreitol, 1 mm Na3VO4, COMPLETE protease inhibitors (Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germany)) and lysed by 20 passages through a 20-gauche syringe. Five units of recombinant human c-Src (Upstate Technologies, Lake Placid, NY) and 10 μCi of [γ-32P]ATP (Amersham Biosciences, Inc.) were mixed with 30 μl of the lysate and incubated for 30 min at 30 °C. In a similar experiment, 1 × 107 SYF cells or SYF+c-src cells, respectively, were lysed in 1 ml of ice-cold kinase buffer as described above. 25 μl of cell lysates were incubated with 25 μl of H. pylori lysate and 10 μCi of [γ-32P]ATP for 10 min. Reactions were stopped by addition of the appropriate amount of 4× reducing sample buffer (200 mm Tris-HCl, pH 6.8, 10% β-mercaptoethanol, 10% SDS, 0.4% bromphenol blue, 40% glycerol) and boiled for 5 min. A C-terminal cagA fragment encoding EPIYA motifs and the Y972F mutant was cloned into the pEGFP-N1 expression vector as an N-terminal fusion to GFP as described (13Backert S. Moese S. Selbach M. Brinkmann V. Meyer T.F. Mol. Microbiol. 2001; 42: 631-644Crossref PubMed Scopus (206) Google Scholar). This fragment corresponds to positions 872–1000 of CagA from the TIGR strain (www.tigr.org/tdb/). Mouse c-src and constitutively activesrc in the mammalian retroviral expression vector pNeoMSV (16Karn J. Watson J.V. Lowe A.D. Green S.M. Vedeckis W. Oncogene. 1989; 4: 773-787PubMed Google Scholar, 17Broome M.A. Hunter T. J. Biol. Chem. 1996; 271: 16798-16806Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (117) Google Scholar). All constructs were transiently transfected into AGS, SYF, and SYF+c-src cells using LipofectAMINE 2000 according to the manufacturer's instructions (Invitrogen). Cells were incubated at 37 °C under 5% CO2 for 16 h and were harvested and subjected to SDS-PAGE. Western blots were probed with a monoclonal phosphotyrosine-specific antibody PY99 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), a monoclonal anti-Src antibody (18Lipsich L.A. Lewis A.J. Brugge J.S. J. Virol. 1983; 48: 352-360Crossref PubMed Google Scholar), anti-Src antibody GD11 (Upstate Technologies), or polyclonal anti-c-Yes and anti-c-Fyn antibodies (Santa Cruz Biotechnology). As a control, we used a monoclonal anti-α-tubulin antibody (Sigma-Aldrich). GFP expression was analyzed with a polyclonal anti-GFP antibody (MoBiTec, Göttingen, Germany). CagA was detected with a polyclonal rabbit anti-CagA antibody (6Stein M. Rappuoli R. Covacci A. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2000; 97: 1263-1268Crossref PubMed Scopus (520) Google Scholar). Two bacterial virulence proteins, CagA and Tir from the human pathogen H. pylori and enteropathogenicEscherichia coli (EPEC), respectively, undergo tyrosine phosphorylation. Phosphorylation of both proteins interferes with host cell signaling events and induces rearrangements of the actin cytoskeleton (4Segal E.D. Cha J., Lo, J. Falkow S. Tompkins L.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 14559-14564Crossref PubMed Scopus (672) Google Scholar, 13Backert S. Moese S. Selbach M. Brinkmann V. Meyer T.F. Mol. Microbiol. 2001; 42: 631-644Crossref PubMed Scopus (206) Google Scholar, 14Higashi, H., Tsutsumi, R., Muto, S., Sugiyama, T., Azuma, T., Asaka, M., and Hatakeyama, M. (2001) Science10-1126/Science.106747Google Scholar, 19Kenny B. Mol. Microbiol. 1999; 31: 1229-1241Crossref PubMed Scopus (203) Google Scholar). Although the initial tyrosine phosphorylation step is crucial, the eukaryotic kinases that phosphorylate both Tir and CagA have not yet been identified. Here, we have analyzed the phosphorylation of the H. pyloriCagA protein by a combination of in vivo and in vitro experiments, which show that Src is the kinase. In general, protein-tyrosine kinases (PTKs) are thought to bind and phosphorylate their substrates depending on the amino acid sequence surrounding the respective tyrosine residue (20Songyang Z. Carraway III K.L. Eck M.J. Harrison S.C. Feldman R.A. Mohammadi M. Schlessinger J. Hubbard S.R. Smith D.P. Eng C. Lorenzo M.J. Ponder B.A.J. Mayer B.J. Cantley L.C. Nature. 1995; 373: 536-539Crossref PubMed Scopus (848) Google Scholar, 21Hunter T. Cell. 2000; 100: 113-127Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2280) Google Scholar). For example, receptor-tyrosine kinases prefer acidic amino acids at the −1 position and bulky lipophilic side chains at the +1 position. On the other hand, the Src family PTKs target tyrosines between an N-terminal lipophilic and a C-terminal small or acidic amino acid (20Songyang Z. Carraway III K.L. Eck M.J. Harrison S.C. Feldman R.A. Mohammadi M. Schlessinger J. Hubbard S.R. Smith D.P. Eng C. Lorenzo M.J. Ponder B.A.J. Mayer B.J. Cantley L.C. Nature. 1995; 373: 536-539Crossref PubMed Scopus (848) Google Scholar). We have previously reported that Tyr-972, but not Tyr-122, Tyr-899, or Tyr-918 of CagA from the TIGR H. pylori strain, is essential for phosphorylation (13Backert S. Moese S. Selbach M. Brinkmann V. Meyer T.F. Mol. Microbiol. 2001; 42: 631-644Crossref PubMed Scopus (206) Google Scholar). Homology searches of this motif revealed that Tyr-972 is well conserved in so-called Glu-Pro-Ile-Tyr-Ala (EPIYA) sequence repeats that were first reported to be a major cause of CagA size variation (22Covacci A. Censini S. Bugnoli M. Petracca R. Burroni D. Macchia G. Massone A. Papini E. Xiang Z. Figura N. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1993; 90: 5791-5795Crossref PubMed Scopus (1121) Google Scholar). Among 27 CagA variants that were selected from the NCBI data base, EPIYA repeats were present in all proteins but at different numbers (Fig. 1 A). The majority of CagA sequences had at least three EPIYA motifs whereas some contained up to five repeats, indicating that this motif is probably of general importance. To reveal if this motif can be recognized by specific kinases, we aligned the EPIYA sequence with consensus target sequences of eukaryotic tyrosine kinases. The EPIYA motif has isoleucine at the −1 position and the small amino acid alanine at the +1 position, which is closely related to the Src phosphorylation consensus motif EEIY(G/E) (Fig. 1 B), suggesting that CagA may be a substrate for tyrosine kinases of the Src family. Interestingly, Asahi et al. (5Asahi M. Azuma T. Ito S. Ito Y. Suto H. Nagai Y. Tsubokawa M. Tohyama Y. Maeda S. Omata M. Suzuki T. Sasakawa C. J. Exp. Med. 2000; 191: 593-602Crossref PubMed Scopus (426) Google Scholar) reported that epidermal growth factor receptor (EGFR) tyrosine kinase can also phosphorylate CagA in vitro. However, the EPIYA motif shows only weak homology to the EGFR consensus sequence (Fig.1 B). To determine whether Src family PTKs are important for CagA phosphorylation, we infected AGS gastric epithelial cells in the presence of PP2, a Src-specific tyrosine kinase inhibitor (23Hanke J.H. Gardner J.P. Dow R.L. Changelian P.S. Brissette W.H. Weringer E.J. Pollok B.A. Connelly P.A. J. Biol. Chem. 1996; 271: 695-701Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1790) Google Scholar). After 5 h, whole cell lysates were prepared and analyzed by anti-phosphotyrosine and anti-CagA immunoblotting. Treatment with PP2 reduced CagA phosphorylation in a dose-dependent manner (Fig. 2 A, upper panel). Even at low concentration (1 μm) PP2 reduced CagA phosphorylation significantly, and CagA phosphorylation was not detectable at 100 μm PP2. Treatment of uninfected AGS cells did not significantly affect tyrosine phosphorylation of most host proteins, demonstrating that PP2 inhibits a specific subset of kinases rather than blocking tyrosine phosphorylation in general (Fig.2 A, upper panel). To demonstrate that equal amounts of CagA and host cell proteins are present, the blots were reprobed with an anti-CagA antibody (middle panel) or anti-α-tubulin antibody (lower panel), respectively. Furthermore, treatment of infected AGS cells with tyrphostins AG1478 (24Levitzky A. Gazit A. Science. 1995; 267: 1782-1788Crossref PubMed Scopus (1628) Google Scholar) or AG370 (25Levitzky A. Gilon C. Trends Pharmacol. Sci. 1991; 12: 171-174Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (123) Google Scholar) as specific inhibitors of EGFR and platelet-derived growth factor receptor (PDGFR) tyrosine kinases, respectively, had no effect on the phosphorylation of CagA during infection even at high doses (Fig. 2 B). Thus, CagA is phosphorylated in vivo by a PP2-sensitive host cell kinase that is different from EGFR and PDGFR. CagA tyrosine phosphorylation has been implicated in signaling events leading to the hummingbird phenotype in AGS cells (4Segal E.D. Cha J., Lo, J. Falkow S. Tompkins L.S. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 1999; 96: 14559-14564Crossref PubMed Scopus (672) Google Scholar, 13Backert S. Moese S. Selbach M. Brinkmann V. Meyer T.F. Mol. Microbiol. 2001; 42: 631-644Crossref PubMed Scopus (206) Google Scholar, 14Higashi, H., Tsutsumi, R., Muto, S., Sugiyama, T., Azuma, T., Asaka, M., and Hatakeyama, M. (2001) Science10-1126/Science.106747Google Scholar). Thus, we analyzed the effect of PP2 on the induction of phenotype changes in infected AGS cells. In the absence of inhibitor, more than 55% of the infected cells were significantly elongated and displayed a spindle-shaped morphology (Fig. 2 C). In the presence of 1 μm PP2 the appearance of this phenotypic alteration was reduced to 25% of the cell population. At 100 μm PP2, infected cells did not show the cellular phenotype, and the number of elongated cells dropped to less than 5% (Fig. 2 C). This result verifies very recent reports (13Backert S. Moese S. Selbach M. Brinkmann V. Meyer T.F. Mol. Microbiol. 2001; 42: 631-644Crossref PubMed Scopus (206) Google Scholar, 14Higashi, H., Tsutsumi, R., Muto, S., Sugiyama, T., Azuma, T., Asaka, M., and Hatakeyama, M. (2001) Science10-1126/Science.106747Google Scholar) demonstrating that CagA tyrosine phosphorylation is necessary to induce downstream signaling leading to the hummingbird phenotype. In the micromolar range, PP2 is regarded as a specific Src family PTK inhibitor (23Hanke J.H. Gardner J.P. Dow R.L. Changelian P.S. Brissette W.H. Weringer E.J. Pollok B.A. Connelly P.A. J. Biol. Chem. 1996; 271: 695-701Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (1790) Google Scholar). However, the possibility that the inhibitory effect of PP2 on CagA phosphorylation in AGS cells may be due to a partial inhibition of other cellular tyrosine kinases cannot be excluded. To verify that Src PTK activity has an impact on CagA phosphorylation in AGS cells we transfected these cells with a c-Src construct, infected them with H. pylori, and analyzed CagA phosphorylation by immunoblotting (Fig.3 A, upper andmiddle panels). CagA phosphorylation in AGS cells overexpressing c-Src was substantially increased when compared with control AGS cells expressing only endogenous Src levels. An even stronger increase in CagA phosphorylation was obtained when AGS cells were transfected with constitutively active Src (data not shown). Therefore, increasing Src family PTK activity (Fig. 3 A,bottom) strongly enhances CagA phosphorylation in AGS cells, indicating that c-Src is an in vivo kinase of this protein. Interestingly, the ability of activated Src variants to induce changes in the cellular morphology has been well documented in other cell types such as fibroblasts (26Tian M. Martin G.S. Mol. Biol. Cell. 1997; 8: 1183-1193Crossref PubMed Scopus (6) Google Scholar, 27Seidel-Dugan C. Meyer B.E. Thomas S.M. Brugge J.S. Mol. Cell. Biol. 1992; 12: 1835-1845Crossref PubMed Scopus (150) Google Scholar). To confirm that CagA can function as a c-Src substrate we performedin vitro kinase assays using recombinant human c-Src incubated with lysates from wild-type and CagA-deficient H. pylori in the presence of [γ-32P]ATP. The lysates were resolved by SDS-PAGE, and CagA phosphorylation was detected by autoradiography (Fig. 3 B, upper panel). In a parallel experiment, these samples were blotted and probed with an anti-CagA antibody (Fig. 3 B, lower panel). Strong phosphorylation of CagA was detected when c-Src was co-incubated with lysate from wild-type H. pylori. Bacterial lysate without c-Src was unable to phosphorylate CagA. As expected, incubation of c-Src with an isogenic H. pylori ΔcagA knockout mutant did not result in CagA phosphorylation. These results demonstrate that CagA serves as a c-Src substrate in vitro. To further investigate the role of Src family PTKs for in vivo CagA phosphorylation we employed fibroblasts derived from c-src −/− ,c-yes −/−, and c-fyn −/− triple knockout mouse embryos (SYF cells) (15Klinghoffer R.A. Sachsenmaier C. Cooper J.A. Soriano P. EMBO J. 1999; 18: 2459-2471Crossref PubMed Scopus (647) Google Scholar). As a control, SYF cells stably re-expressing c-Src were used (SYF+c-src) (Fig.4 A). Because H. pylori was unable to translocate CagA into these cells, we first prepared cell lysates and performed in vitro CagA phosphorylation assays as described above. Whereas SYF cell lysates did not support CagA phosphorylation, lysates prepared from SYF+c-src cells strongly induced CagA tyrosine phosphorylation (Fig. 4 B, arrowhead). Reprobing of the blot with an anti-CagA antibody showed identical CagA amounts present (data not shown). This result indicated that cellular Src family PTKs (in particular Src, Yes, or Fyn) are essential for CagA phosphorylation. To determine which of these Src family members are expressed in AGS gastric epithelial cells we probed whole cell lysates with antibodies to c-Src, c-Yes, and c-Fyn (Fig. 4 C). NIH 3T3 fibroblasts were used as a positive control (right lanes). We found that c-Src and c-Yes are strongly expressed in AGS cells whereas c-Fyn expression was very low (Fig. 4 C,arrowheads). This indicated that the Src family members c-Src and/or c-Yes might be major kinases of CagA in vivo. To prove that Src family kinases mediate CagA phosphorylation in vivo, we fused a 15-kDa C-terminal CagA fragment containing the EPIYA motifs to green fluorescent protein (EPIYA-GFP, see Fig.1 B). In addition, we generated a construct in which Tyr-972 of the C-terminal EPIYA repeat has been replaced by phenylalanine (EPIFA-GFP). These constructs were transiently expressed in SYF and SYF+c-src cells, and phosphorylation of the EPIYA/EPIFA-GFP fusion proteins was determined by immunoblotting (Fig.5, upper panel). Expression levels of the constructs were determined using an anti-GFP antibody (Fig. 5, middle panel). To assure that equal amounts of protein were present in each lane the blot was reprobed with an anti-α-tubulin antibody. Significantly, we observed a very faint band for phosphorylated wild-type EPIYA-GFP protein in SYF cells (only after long exposure times) and no signal for the EPIFA-GFP construct. However, SYF+c-src cells revealed strong phosphorylation of the wild-type EPIYA-GFP fusion construct and a faint band for the phosphorylated EPIFA-GFP protein. Densitometric analysis of CagA-GFP expression and tyrosine phosphorylation levels revealed that SYF+c-src cells induced more than 30-fold stronger phosphorylation of the CagA-GFP fusion protein than SYF cells. Thus, Src family kinases contribute to the majority of CagA phosphorylationin vivo, and c-Src re-expression in SYF cells is sufficient to mediate CagA tyrosine phosphorylation in vivo. Moreover, Tyr-972 of the distal EPIYA repeat of CagA from the TIGR strain appears to be the major Src kinase phosphorylation site within the CagA sequence. CagA is regarded as an important H. pylori virulence factor that induces a transformed phenotype upon translocation into gastric epithelial cells. A recent report has shown that the phosphatase Shp-2 binds CagA in a phosphotyrosine-dependent manner and plays a role in downstream signaling (14Higashi, H., Tsutsumi, R., Muto, S., Sugiyama, T., Azuma, T., Asaka, M., and Hatakeyama, M. (2001) Science10-1126/Science.106747Google Scholar). Here, we identify Src family kinases as additional host cell proteins that specifically interact with CagA. Inhibition of Src with the specific inhibitor PP2 prevents phosphorylation of CagA and CagA-dependent cytoskeletal rearrangements. As phosphorylation precedes virtually all effects induced by CagA, phosphorylation of CagA by Src-like PTKs is likely to be the initial event critically involved in CagA-induced host cell signaling. Furthermore, we identified a conserved EPIYA motif in CagA as a specific Src target site. CagA sequences from other H. pylori isolates contain varying numbers of EPIYA repeats that could allow for multiple phosphorylation events. Given that CagA phosphorylation is essential for modulating cellular functions,H. pylori would potentially be able to modify the effects of CagA by varying the number of EPIYA repeats. It is tempting to speculate that the number of phosphorylation sites present in CagA correlates with the degree of pathogenic effects induced during infection with H. pylori. We thank Julia Blass and Christian Sommer for excellent technical assistance. We thank Antonello Covacci and Stefano Censini (Chiron, Siena, Italy) for providing an anti-CagA antiserum, Tony Hunter (Salk Institute, La Jolla, CA) for the c-Src expression construct, and Phil Soriano (FHCRC, Seattle, WA) for the SYF cells.

Helicobacter pylori is one of the most common bacterial pathogens, infecting about 50% of the world population.The presence of a pathogenicity island (PAI) in H. pylori has been associated with gastric disease.We present evidence that the H. pylori protein encoded by the cytotoxin-associated gene A (cagA) is translocated and phosphorylated in infected epithelial cells.Two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) of proteins isolated from infected AGS cells revealed H. pylori strain-specific and timedependent tyrosine phosphorylation and dephosphorylation of several 125±135 kDa and 75±80 kDa proteins.Immunoblotting studies, matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS), cell fractionation and confocal microscopy demonstrated that one of the 125±135 kDa proteins represents the H. pylori CagA protein, which is translocated into the host cell membrane and the cytoplasm.Translocation of CagA was dependent on functional cagA gene and virulence (vir) genes of a type IV secretion apparatus composed of virB4, virB7, virB10, virB11 and virD4 encoded in the cag PAI of H. pylori.Our findings support the view that H. pylori actively translocates virulence determinants, including CagA, which could be involved in the development of a variety of gastric disease.

Abstract The epithelial lining of the fallopian tube is of critical importance for human reproduction and has been implicated as a site of origin of high-grade serous ovarian cancer. Here we report on the establishment of long-term, stable 3D organoid cultures from human fallopian tubes, indicative of the presence of adult stem cells. We show that single epithelial stem cells in vitro can give rise to differentiated organoids containing ciliated and secretory cells. Continuous growth and differentiation of organoids depend on both Wnt and Notch paracrine signalling. Microarray analysis reveals that inhibition of Notch signalling causes downregulation of stem cell-associated genes in parallel with decreased proliferation and increased numbers of ciliated cells and that organoids also respond to oestradiol and progesterone treatment in a physiological manner. Thus, our organoid model provides a much-needed basis for future investigations of signalling routes involved in health and disease of the fallopian tube.

To investigate the significance of silent gene loci for pilus antigenic variation in N. gonorrhoeae, we determined the nucleotide sequence of the major silent locus, pilS1. The pilS1 locus contains six tandem pilus gene copies linked by a 39 bp repeat sequence also present in the expression loci. All silent copies lack the common N-terminal coding sequence of pilin, containing instead variant sequence information that constitutes a semivariable (SV) and a hypervariable (HV) domain. The SV and HV domains are interspersed with short, strictly conserved (C) regions flanking small cassettes of variable sequence information. It appears that such minicassettes from silent copies can be duplicated and transferred to other silent or expression genes by means of gene conversion.

The Neisseria gonorrhoeae pilus protein is one of the major antigenic determinants on the cell's surface. It is comprised of identical subunits of approximately 18 kd and plays a role in the infectivity and virulence of the organism. We have cloned the gene encoding a gonococcal pilus protein into Escherichia coli, and, using one of these clones as a probe in hybridization studies, we have shown that conversion of the pilus positive to pilus negative state in N. gonorrhoeae involves chromosomal rearrangement. Although the pilus protein is produced by E. coli, it does not appear to be assembled on the surface of the cell in native form.

The use of chemically synthesized short interfering RNAs (siRNAs) is currently the method of choice to manipulate gene expression in mammalian cell culture, yet improvements of siRNA design is expectably required for successful application in vivo. Several studies have aimed at improving siRNA performance through the introduction of chemical modifications but a direct comparison of these results is difficult. We have directly compared the effect of 21 types of chemical modifications on siRNA activity and toxicity in a total of 2160 siRNA duplexes. We demonstrate that siRNA activity is primarily enhanced by favouring the incorporation of the intended antisense strand during RNA-induced silencing complex (RISC) loading by modulation of siRNA thermodynamic asymmetry and engineering of siRNA 3′-overhangs. Collectively, our results provide unique insights into the tolerance for chemical modifications and provide a simple guide to successful chemical modification of siRNAs with improved activity, stability and low toxicity.