The generation of synthetic compounds with exclusive target specificity is an extraordinary challenge of molecular recognition and demands novel design strategies, in particular for large and homologous protein families such as protein kinases with more than 500 members. Simple organic molecules often do not reach the necessary sophistication to fulfill this task. Here, we present six carefully tailored, stable metal-containing compounds in which unique and defined molecular geometries with natural-product-like structural complexity are constructed around octahedral ruthenium(II) or iridium(III) metal centers. Each of the six reported metal compounds displays high selectivity for an individual protein kinase, namely GSK3α, PAK1, PIM1, DAPK1, MLCK, and FLT4. Although being conventional ATP-competitive inhibitors, the combination of the unusual globular shape and rigidity characteristics, of these compounds facilitates the design of highly selective protein kinase inhibitors. Unique structural features of the octahedral coordination geometry allow novel interactions with the glycine-rich loop, which contribute significantly to binding potencies and selectivities. The sensitive correlation between metal coordination sphere and inhibition properties suggests that in this design, the metal is located at a "hot spot" within the ATP binding pocket, not too close to the hinge region where globular space is unavailable, and at the same time not too far out toward the solvent where the octahedral coordination sphere would not have a significant impact on potency and selectivity. This study thus demonstrates that inert (stable) octahedral metal complexes are sophisticated structural scaffolds for the design of highly selective chemical probes.

Given the dependence of cancers on de novo lipogenesis, we tested the effect of fatostatin, a small molecule thought to target this pathway by blocking activation of SREBP transcription factors, in breast cancer cell lines and xenograft tumors. We found that estrogen receptor (ER) positive cells were more sensitive to fatostatin than ER negative cells and responded with cell cycle arrest and apoptosis. Surprisingly, we found that rather than inhibiting lipogenesis, fatostatin caused an accumulation of lipids as a response to endoplasmic reticulum stress rather than inhibition of SREBP activity. In particular, ceramide and dihydroceramide levels increased and contributed to the apoptotic effects of fatostatin. In addition, an accumulation of triacylglycerides (TAGs), particularly those containing polyunsaturated fatty acids (PUFAs), was also observed as a result of elevated diacylglycerol transferase activity. Blocking PUFA-TAG production enhanced the apoptotic effect of fatostatin, suggesting that these lipids play a protective role and limit fatostatin response. Together, these findings indicate that the ability of breast cancer cells to respond to fatostatin depends on induction of endoplasmic reticulum stress and subsequent ceramide accumulation, and that limiting production of PUFA-TAGs may be therapeutically beneficial in specific tumor subtypes.

Abstract Per- and polyfluorinated alkyl substances (PFAS) are ubiquitous in most environments, accumulate in several tissues, and can adversely affect human health. PFAS have been implicated in neurodegenerative and behavioral disorders. However, the mechanisms through which PFAS affects biological function in neurons mostly remain unknown. In this study, SH-SY5Y neuroblastoma cells were used to study the effect of perfluorooctanoic acid (PFOA), perfluorooctansulfonic acid (PFOS), perfluorodecanoic acid (PFDA), perfluorodecanesulfonic acid (PFDS), 8:2 fluorotelomer sulfonate (8:2 FTS) and 8:2 fluorotelomer alcohol (8:2 FTOH) exposures on neuronal health. After a 30 μM-, 24-hour exposure, cells accumulated up to 800 ng PFAS/mg protein. Transcriptomics analysis of control and PFAS-exposed cells revealed 721 genes were differentially expressed across six treatments (p adj < 0.05). Eleven of these differentially expressed genes were observed for all treatments, suggesting that these genes are potential markers for neuronal PFAS exposure. In PFOA-treated cells, we observed multiple downregulated genes are enriched for functions related to synaptic growth and neural function. In contrast, upregulated genes in PFOS, PFDS, FTS, and FTOH-treated cells showed enrichment in functions related to response to hypoxia and amino acid metabolism, suggesting PFAS impact different cellular processes in neuronal cells based on their chemical composition and structure. Consistent with this observation, analysis of major lipid classes after exposure to select PFAS showed significant upregulation of fatty acids with PFDA, PFDS and 8:2 FTS and downregulation of triacylglycerols with 8:2 FTOH exposure. Overall, these results suggest that PFAS induce different effects in vitro depending on their chemical structures and specific biological processes that potentially underlie negative effects of PFAS on neuronal health. Synopsis Per- and poly fluorinated alkyl substances (PFAS) have been shown to bioaccumulate in human tissues and affect health. This study aims to provide insight into the specific biological processes by which PFAS exposure affects neuronal cells.

ABSTRACT Metabolic adaptations in response to changes in energy supply and demand are essential for survival. The mitochondrial calcium uniporter coordinates metabolic homeostasis by regulating TCA cycle activation, mitochondrial fatty acid oxidation and cellular calcium signaling. However, a comprehensive analysis of uniporter-regulated mitochondrial metabolic pathways has remained unexplored. Here, we investigate the metabolic consequences of uniporter loss- and gain-of-function, and identify a key transcriptional regulator that mediates these effects. Using gene expression profiling and proteomic, we find that loss of uniporter function increases the expression of proteins in the branched-chain amino acid (BCAA) catabolism pathway. Activity is further augmented through phosphorylation of the enzyme that catalyzes this pathway’s committed step. Conversely, in the liver cancer fibrolamellar carcinoma (FLC)-which we demonstrate to have high mitochondrial calcium levels-expression of BCAA catabolism enzymes is suppressed. We also observe uniporter-dependent suppression of the transcription factor KLF15, a master regulator of liver metabolic gene expression, including those involved in BCAA catabolism. Notably, loss of uniporter activity upregulates KLF15, along with its transcriptional target ornithine transcarbamylase (OTC), a component of the urea cycle, suggesting that uniporter hyperactivation may contribute to the hyperammonemia observed in FLC patients. Collectively, we establish that FLC has increased mitochondrial calcium levels, and identify an important role for mitochondrial calcium signaling in metabolic adaptation through the transcriptional regulation of metabolism.

The deletion of the third exon of the growth hormone receptor ( GHRd3 ) is one of the most common genomic structural variants in the human genome. This deletion has been linked to response to growth hormone, placenta size, birth weight, growth after birth, time of menarche, adult height, and longevity. However, its evolutionary history and the exact mechanisms through which it affects phenotypes remain unresolved. While the analysis of thousands of genomes suggests that this deletion was nearly fixed in the ancestral population of anatomically modern humans and Neanderthals, it underwent a paradoxical adaptive reduction in frequency approximately 30 thousand years ago, a demographic signature that roughly corresponds with the emergence of multiple modern human behaviors and a concurrent population expansion. Using a mouse line engineered to contain the deletion, pleiotropic and sex-specific effects on organismal growth, the expression levels of hundreds of genes, and serum lipid composition were documented, potentially involving the nutrient-dependent mTORC1 pathway. These growth and metabolic effects are consistent with a model in which the allele frequency of GHRd3 varies throughout human evolution as a response to fluctuations in resource availability. The last distinctive prehistoric shift in allele frequency might be related to newly developed technological buffers against the effects of oscillating resource levels.

It is well established that cancer cells depend on de novo lipid synthesis to provide necessary membrane and signaling lipids for cell proliferation and survival. Sterol regulatory element‐binding protein 1 (SREBP1) is a transcription factor that plays a major role in regulating de novo lipogenesis in lipid‐depleted conditions. SREBP1 is blocked by the antitumor agent fatostatin (FS), which inhibits SREBP cleavage‐activating protein and prevents SREBP activation. Antitumor properties of FS include the inhibition of cancer cell proliferation, invasion, and migration, and activation of apoptosis. Precise mechanisms for these properties of FS are poorly understood. Here, we investigated whether changes in lipid species occur in response to FS treatment and, if so, which lipids may contribute to the anti‐cancer effects of FS. We find that treating MCF‐7 or T47D breast cancer cells with FS in lipid‐depleted media inhibits SREBP translocation into the nucleus and transcription of SREBP‐dependent lipogenic genes. In addition, cell proliferation is inhibited while the number of dead cells increases, based on propidium iodide staining. Surprisingly, treatment of cells with FS in lipid‐rich conditions also caused a decrease in cell proliferation and viability and promoted apoptosis, as measured by caspase 3/7 activity and annexin V staining. A global lipidomic analysis revealed increased production of ceramide in response to FS, which may contribute to its apoptotic effects. Unexpectedly, FS also induces a 2–3 fold increase in long‐chain polyunsaturated fatty acids (PUFAs), which appear to accumulate in triacylglerides (TAGs). In fact, a clear increase in intracellular TAG‐enriched lipid droplets was evident by Nile Red staining after FS treatment. The increase in PUFA levels is associated with an increase in desaturase and elongase gene expression in response to FS. The increase of TAG accumulation is associated with desaturase and diglycerol acyltransferase (DGAT) activity. To determine the functional role of unsaturated fatty acids and TAG accumulation, cells were treated with delta6‐desaturase inhibitor (SC‐26196, 1 uM), or stearoyl‐CoA desaturase‐1 (SCD1) inhibitor (CAY10566, 1 uM) or a mixture of DGAT1 and DGAT2 inhibitors (PF‐04620110 + PF‐06424439, 1 uM + 1 uM) in the presence or absence of FS. Without FS, inhibitors have no effect or slightly increase proliferation whereas co‐treatment with FS further enhanced apoptosis over FS alone, suggesting that fatty acid desaturation and elongation, as well as accumulation of PUFAs in TAGs, represent a cellular defense mechanism against FS triggered lipotoxicity. Moreover, these findings imply that the efficiency of FS as an anticancer drug could be increased by combination therapies with desaturases or DGAT inhibitors, which would represent a novel approach to breast cancer treatment. Support or Funding Information This study was supported by the NIH fund CA196930 01

Mixed lineage kinase domain-like (MLKL) is a key signaling protein of necroptosis. MLKL oligomerizes and translocates to the plasma membrane upon phosphorylation by the necrosome. At the plasma membrane, MLKL induces membrane permeabilization which contributes to the inflammatory activity of necroptosis. Membrane binding of MLKL oligomers is initially initiated by the electrostatic interaction between the protein and membrane phospholipids. We have previously showed that MLKL and its phosphorylated form (pMLKL) are S-acylated during necroptosis and that this acylation increases their membrane binding. In this work, we characterize acylation sites of MLKL and identify multiple cysteines that can undergo acylation with an interesting promiscuity at play. Our results show that MLKL and pMLKL undergo monoacylation, with C184, C269 and C286 being the possible acylation sites. In other words, while there are multiple cysteines that are accessible for acylation, the acylation predominantly occurs at a single cysteine. The molecular interactions that determine the exact acylation site remain unclear. Investigating the S-palmitoyltransferases that might acylate MLKL in necroptosis, we showed that zDHHC21 activity has the strongest effect on pMLKL acylation and reducing the activity of zDHHC21 significantly improved membrane integrity of necroptotic cells. We also observed that inactivation of zDHHC21 reduced the pMLKL levels in the cells, suggesting that blocking the acylation of pMLKL results in reduced membrane binding, destabilization of the protein at the membrane interface and cause its degradation. Finally, through molecular dynamics simulations, we verify the acyl tail of MLKL can insert into the membrane and causes conformational changes to the protein and lipid re-organization of the membrane. At a broader level, our findings shed light onto pMLKL processing and the effect of S-acylation on pMLKL functioning in necroptosis.

Per- and polyfluorinated alkyl substances (PFAS) are pervasive environmental contaminants that bioaccumulate in tissues and pose risks to human health. Increasing evidence links PFAS to neurodegenerative and behavioral disorders, yet the underlying mechanisms of their effects on neuronal function remain largely unexplored. In this study, we utilized SH-SY5Y neuroblastoma cells, differentiated into neuronal-like cells, to investigate the impact of six PFAS compounds─perfluorooctanoic acid (PFOA), perfluorooctanesulfonic acid (PFOS), perfluorodecanoic acid (PFDA), perfluorodecanesulfonic acid (PFDS), 8:2 fluorotelomer sulfonate (8:2 FTS), and 8:2 fluorotelomer alcohol (8:2 FTOH)─on neuronal health. Following a 30 μM exposure for 24 h, PFAS accumulation ranged from 40–6500 ng/mg of protein. Transcriptomic analysis revealed 721 differentially expressed genes (DEGs) across treatments (padj < 0.05), with 11 DEGs shared among all PFAS exposures, indicating potential biomarkers for neuronal PFAS toxicity. PFOA-treated cells showed downregulation of genes involved in synaptic growth and neural function, while PFOS, PFDS, 8:2 FTS, and 8:2 FTOH exposures resulted in the upregulation of genes related to hypoxia response and amino acid metabolism. Lipidomic profiling further demonstrated significant increases in fatty acid levels with PFDA, PFDS, and 8:2 FTS and depletion of triacylglycerols with 8:2 FTOH treatments. These findings suggest that the neurotoxic effects of PFAS are structurally dependent, offering insights into the molecular processes that may drive PFAS-induced neuronal dysfunction.

Cellular senescence, the irreversible ceasing of cell division, has been associated with organismal aging, prevention of cancerogenesis, and developmental processes. As such, the evolutionary basis and biological features of cellular senescence remain a fascinating area of research. In this study, we conducted comparative RNAseq experiments to detect genes associated with replicative senescence in two different human cell lines and at different time points. We identified 841 and 900 genes (core senescence-associated genes) that are significantly up- and downregulated in senescent cells, respectively, in both cell lines. Our functional enrichment analysis showed that downregulated core genes are primarily involved in cell cycle processes while upregulated core gene enrichment indicated various lipid-related processes. We further demonstrated that downregulated genes are significantly more conserved than upregulated genes. Using both transcriptomics and genetic variation data, we identified one of the upregulated, lipid metabolism gene, CD36 as an outlier. We found that overexpression of CD36 induces a senescence-like phenotype and, further, the media of CD36-overexpressing cells alone can induce a senescence-like phenotype in proliferating young cells. Moreover, we used a targeted lipidomics approach and showed that phosphatidylcholines accumulate during senescence in these cells, suggesting that upregulation of CD36 could contribute to membrane remodeling during senescence. Overall, these results contribute to the understanding of evolution and biology of cellular senescence and identify several targets and questions for future studies.