RNA-Seq of single cells has been limited by biases in transcript coverage and unknown technical variability. Ramsköld et al. describe a protocol to reproducibly recover full-length transcripts and use it to quantitatively analyze splice isoforms in single cells. Genome-wide transcriptome analyses are routinely used to monitor tissue-, disease- and cell type–specific gene expression, but it has been technically challenging to generate expression profiles from single cells. Here we describe a robust mRNA-Seq protocol (Smart-Seq) that is applicable down to single cell levels. Compared with existing methods, Smart-Seq has improved read coverage across transcripts, which enhances detailed analyses of alternative transcript isoforms and identification of single-nucleotide polymorphisms. We determined the sensitivity and quantitative accuracy of Smart-Seq for single-cell transcriptomics by evaluating it on total RNA dilution series. We found that although gene expression estimates from single cells have increased noise, hundreds of differentially expressed genes could be identified using few cells per cell type. Applying Smart-Seq to circulating tumor cells from melanomas, we identified distinct gene expression patterns, including candidate biomarkers for melanoma circulating tumor cells. Our protocol will be useful for addressing fundamental biological problems requiring genome-wide transcriptome profiling in rare cells.

Our understanding of Alzheimer's disease pathogenesis is currently limited by difficulties in obtaining live neurons from patients and the inability to model the sporadic form of the disease. It may be possible to overcome these challenges by reprogramming primary cells from patients into induced pluripotent stem cells (iPSCs). Here we reprogrammed primary fibroblasts from two patients with familial Alzheimer's disease, both caused by a duplication of the amyloid-β precursor protein gene (APP; termed APP(Dp)), two with sporadic Alzheimer's disease (termed sAD1, sAD2) and two non-demented control individuals into iPSC lines. Neurons from differentiated cultures were purified with fluorescence-activated cell sorting and characterized. Purified cultures contained more than 90% neurons, clustered with fetal brain messenger RNA samples by microarray criteria, and could form functional synaptic contacts. Virtually all cells exhibited normal electrophysiological activity. Relative to controls, iPSC-derived, purified neurons from the two APP(Dp) patients and patient sAD2 exhibited significantly higher levels of the pathological markers amyloid-β(1-40), phospho-tau(Thr 231) and active glycogen synthase kinase-3β (aGSK-3β). Neurons from APP(Dp) and sAD2 patients also accumulated large RAB5-positive early endosomes compared to controls. Treatment of purified neurons with β-secretase inhibitors, but not γ-secretase inhibitors, caused significant reductions in phospho-Tau(Thr 231) and aGSK-3β levels. These results suggest a direct relationship between APP proteolytic processing, but not amyloid-β, in GSK-3β activation and tau phosphorylation in human neurons. Additionally, we observed that neurons with the genome of one sAD patient exhibited the phenotypes seen in familial Alzheimer's disease samples. More generally, we demonstrate that iPSC technology can be used to observe phenotypes relevant to Alzheimer's disease, even though it can take decades for overt disease to manifest in patients.

DNA methylation is a critical epigenetic regulator in mammalian development. Here, we present a whole-genome comparative view of DNA methylation using bisulfite sequencing of three cultured cell types representing progressive stages of differentiation: human embryonic stem cells (hESCs), a fibroblastic differentiated derivative of the hESCs, and neonatal fibroblasts. As a reference, we compared our maps with a methylome map of a fully differentiated adult cell type, mature peripheral blood mononuclear cells (monocytes). We observed many notable common and cell-type-specific features among all cell types. Promoter hypomethylation (both CG and CA) and higher levels of gene body methylation were positively correlated with transcription in all cell types. Exons were more highly methylated than introns, and sharp transitions of methylation occurred at exon-intron boundaries, suggesting a role for differential methylation in transcript splicing. Developmental stage was reflected in both the level of global methylation and extent of non-CpG methylation, with hESC highest, fibroblasts intermediate, and monocytes lowest. Differentiation-associated differential methylation profiles were observed for developmentally regulated genes, including the HOX clusters, other homeobox transcription factors, and pluripotence-associated genes such as POU5F1, TCF3, and KLF4. Our results highlight the value of high-resolution methylation maps, in conjunction with other systems-level analyses, for investigation of previously undetectable developmental regulatory mechanisms.

Genomic stability is critical for the clinical use of human embryonic and induced pluripotent stem cells. We performed high-resolution SNP (single-nucleotide polymorphism) analysis on 186 pluripotent and 119 nonpluripotent samples. We report a higher frequency of subchromosomal copy number variations in pluripotent samples compared to nonpluripotent samples, with variations enriched in specific genomic regions. The distribution of these variations differed between hESCs and hiPSCs, characterized by large numbers of duplications found in a few hESC samples and moderate numbers of deletions distributed across many hiPSC samples. For hiPSCs, the reprogramming process was associated with deletions of tumor-suppressor genes, whereas time in culture was associated with duplications of oncogenic genes. We also observed duplications that arose during a differentiation protocol. Our results illustrate the dynamic nature of genomic abnormalities in pluripotent stem cells and the need for frequent genomic monitoring to assure phenotypic stability and clinical safety.

Cell-free DNA (cfDNA) testing for fetal trisomy is highly effective among high-risk women. However, there have been few direct, well-powered studies comparing cfDNA testing with standard screening during the first trimester in routine prenatal populations.

ObjectiveWe sought to evaluate performance of a noninvasive prenatal test for fetal trisomy 21 (T21) and trisomy 18 (T18).Study DesignA multicenter cohort study was performed whereby cell-free DNA from maternal plasma was analyzed. Chromosome-selective sequencing on chromosomes 21 and 18 was performed with reporting of an aneuploidy risk (High Risk or Low Risk) for each subject.ResultsOf the 81 T21 cases, all were classified as High Risk for T21 and there was 1 false-positive result among the 2888 normal cases, for a sensitivity of 100% (95% confidence interval [CI], 95.5–100%) and a false-positive rate of 0.03% (95% CI, 0.002–0.20%). Of the 38 T18 cases, 37 were classified as High Risk and there were 2 false-positive results among the 2888 normal cases, for a sensitivity of 97.4% (95% CI, 86.5–99.9%) and a false-positive rate of 0.07% (95% CI, 0.02–0.25%).ConclusionChromosome-selective sequencing of cell-free DNA and application of an individualized risk algorithm is effective in the detection of fetal T21 and T18. We sought to evaluate performance of a noninvasive prenatal test for fetal trisomy 21 (T21) and trisomy 18 (T18). A multicenter cohort study was performed whereby cell-free DNA from maternal plasma was analyzed. Chromosome-selective sequencing on chromosomes 21 and 18 was performed with reporting of an aneuploidy risk (High Risk or Low Risk) for each subject. Of the 81 T21 cases, all were classified as High Risk for T21 and there was 1 false-positive result among the 2888 normal cases, for a sensitivity of 100% (95% confidence interval [CI], 95.5–100%) and a false-positive rate of 0.03% (95% CI, 0.002–0.20%). Of the 38 T18 cases, 37 were classified as High Risk and there were 2 false-positive results among the 2888 normal cases, for a sensitivity of 97.4% (95% CI, 86.5–99.9%) and a false-positive rate of 0.07% (95% CI, 0.02–0.25%). Chromosome-selective sequencing of cell-free DNA and application of an individualized risk algorithm is effective in the detection of fetal T21 and T18.

The pervasive expression of circular RNA is a recently discovered feature of gene expression in highly diverged eukaryotes, but the functions of most circular RNAs are still unknown. Computational methods to discover and quantify circular RNA are essential. Moreover, discovering biological contexts where circular RNAs are regulated will shed light on potential functional roles they may play. We present a new algorithm that increases the sensitivity and specificity of circular RNA detection by discovering and quantifying circular and linear RNA splicing events at both annotated and un-annotated exon boundaries, including intergenic regions of the genome, with high statistical confidence. Unlike approaches that rely on read count and exon homology to determine confidence in prediction of circular RNA expression, our algorithm uses a statistical approach. Using our algorithm, we unveiled striking induction of general and tissue-specific circular RNAs, including in the heart and lung, during human fetal development. We discover regions of the human fetal brain, such as the frontal cortex, with marked enrichment for genes where circular RNA isoforms are dominant. The vast majority of circular RNA production occurs at major spliceosome splice sites; however, we find the first examples of developmentally induced circular RNAs processed by the minor spliceosome, and an enriched propensity of minor spliceosome donors to splice into circular RNA at un-annotated, rather than annotated, exons. Together, these results suggest a potentially significant role for circular RNA in human development.

Classifiers trained on a large microarray gene expression dataset can assess pluripotency in query samples of human cells. Pluripotent stem cells (PSCs) are defined by their potential to generate all cell types of an organism. The standard assay for pluripotency of mouse PSCs is cell transmission through the germline, but for human PSCs researchers depend on indirect methods such as differentiation into teratomas in immunodeficient mice. Here we report PluriTest, a robust open-access bioinformatic assay of pluripotency in human cells based on their gene expression profiles.

Human pluripotent stem cells (hPSCs) are potential sources of cells for modeling disease and development, drug discovery, and regenerative medicine. However, it is important to identify factors that may impact the utility of hPSCs for these applications. In an unbiased analysis of 205 hPSC and 130 somatic samples, we identified hPSC-specific epigenetic and transcriptional aberrations in genes subject to X chromosome inactivation (XCI) and genomic imprinting, which were not corrected during directed differentiation. We also found that specific tissue types were distinguished by unique patterns of DNA hypomethylation, which were recapitulated by DNA demethylation during in vitro directed differentiation. Our results suggest that verification of baseline epigenetic status is critical for hPSC-based disease models in which the observed phenotype depends on proper XCI or imprinting and that tissue-specific DNA methylation patterns can be accurately modeled during directed differentiation of hPSCs, even in the presence of variations in XCI or imprinting.

The highly transmissible B.1.1.7 variant of SARS-CoV-2, first identified in the United Kingdom, has gained a foothold across the world. Using S gene target failure (SGTF) and SARS-CoV-2 genomic sequencing, we investigated the prevalence and dynamics of this variant in the United States (US), tracking it back to its early emergence. We found that, while the fraction of B.1.1.7 varied by state, the variant increased at a logistic rate with a roughly weekly doubling rate and an increased transmission of 40%-50%. We revealed several independent introductions of B.1.1.7 into the US as early as late November 2020, with community transmission spreading it to most states within months. We show that the US is on a similar trajectory as other countries where B.1.1.7 became dominant, requiring immediate and decisive action to minimize COVID-19 morbidity and mortality.