Extinction of conditioned fear is an important model both of inhibitory learning and of behavior therapy for human anxiety disorders. Like other forms of learning, extinction learning is long-lasting and depends on regulated gene expression. Epigenetic mechanisms make an important contribution to persistent changes in gene expression; therefore, in these studies, we have investigated whether epigenetic regulation of gene expression contributes to fear extinction. Since brain-derived neurotrophic factor (BDNF) is crucial for synaptic plasticity and for the maintenance of long-term memory, we examined histone modifications around two BDNF gene promoters after extinction of cued fear, as potential targets of learning-induced epigenetic regulation of gene expression. Valproic acid (VPA), used for some time as an anticonvulsant and a mood stabilizer, modulates the expression of BDNF, and is a histone deacetylase (HDAC) inhibitor. Here, we report that extinction of conditioned fear is accompanied by a significant increase in histone H4 acetylation around the BDNF P4 gene promoter and increases in BDNF exon I and IV mRNA expression in prefrontal cortex, that VPA enhances long-term memory for extinction because of its HDAC inhibitor effects, and that VPA potentiates the effect of weak extinction training on histone H4 acetylation around both the BDNF P1 and P4 gene promoters and on BDNF exon IV mRNA expression. These results suggest a relationship between histone H4 modification, epigenetic regulation of BDNF gene expression, and long-term memory for extinction of conditioned fear. In addition, they suggest that HDAC inhibitors may become a useful pharmacological adjunct to psychotherapy for human anxiety disorders.

Schizophrenia (SZ) is a complex disease characterized by impaired neuronal functioning. Although defective alternative splicing has been linked to SZ, the molecular mechanisms responsible are unknown. Additionally, there is limited understanding of the early transcriptomic responses to neuronal activation. Here, we profile these transcriptomic responses and show that long non-coding RNAs (lncRNAs) are dynamically regulated by neuronal activation, including acute downregulation of the lncRNA Gomafu, previously implicated in brain and retinal development. Moreover, we demonstrate that Gomafu binds directly to the splicing factors QKI and SRSF1 (serine/arginine-rich splicing factor 1) and dysregulation of Gomafu leads to alternative splicing patterns that resemble those observed in SZ for the archetypal SZ-associated genes DISC1 and ERBB4. Finally, we show that Gomafu is downregulated in post-mortem cortical gray matter from the superior temporal gyrus in SZ. These results functionally link activity-regulated lncRNAs and alternative splicing in neuronal function and suggest that their dysregulation may contribute to neurological disorders.

Early life experiences shape an individual's physical and mental health across the lifespan. Not surprisingly, an upbringing that is associated with adversity can produce detrimental effects on health. A central theme that arises from studies in human and nonhuman species is that the effects of adversity are mediated by the interactions between a mother and her young. In this review we describe some of the long-term effects of maternal care on the offspring and we focus on the impact of naturally occurring variations in the behavior of female rats. Of particular interest are mothers that engage in high or low amounts of licking/grooming (LG) and arched-back nursing (ABN) of their pups, but do so within the normal range for this species. Such variations in LG-ABN can alter the function of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) axis, and cognitive and emotional development by directly affecting the underlying neural mechanisms. At the heart of these mechanisms is gene expression. By studying the hippocampal glucocorticoid receptor gene, we have identified that maternal care regulates its expression by changing two processes: the acetylation of histones H3-K9, and the methylation of the NGFI-A consensus sequence on the exon 1(7) promoter. Sustained "maternal effects" appear elsewhere in biology, including plants, insects, and lizards, and may have evolved to program advantages in the environments that the offspring will likely face as adults. Given the importance of early life and parent-child interactions to later behavior, prevention and intervention programs should target this critical phase of development.

Summary Long noncoding RNAs (lncRNAs) represent a multidimensional class of regulatory molecules involved in many aspects of brain function. Emerging evidence indicates that lncRNAs are expressed at the synapse; however, a direct role for their activity in this subcellular compartment in memory formation has yet to be demonstrated. Using lncRNA capture-seq on synaptosomes, we identified a significant number of lncRNAs that accumulate at synapses within the infralimbic prefrontal cortex of adult male C57/Bl6 mice. Among these is a splice variant related to the stress-associated lncRNA, Gas5. RNA immunoprecipitation followed by mass spectrometry and single molecule imaging revealed that this Gas5 isoform, in association with the RNA binding proteins G3bp2 and Caprin1, regulates the activity-dependent trafficking and clustering of RNA granules in dendrites. In addition, we found that cell-type-specific, state-dependent, and synapse-specific knockdown of the Gas5 variant led to impaired fear extinction memory. These findings identify a new mechanism of fear extinction that involves the dynamic interaction between local lncRNA activity and the coordination of RNA condensates in the synaptic compartment.

Abstract A self-cleaving ribozyme mapping to an intron of the cytoplasmic polyadenylation element binding protein 3 ( CPEB3 ) gene has been suggested to play a role in human episodic memory, but the underlying mechanisms mediating this effect are not known. The ribozyme’s self-scission half-life matches the time it takes an RNA polymerase to reach the immediate downstream exon, suggesting that the ribozyme-dependent intron cleavage is tuned to co-transcriptional splicing of the CPEB3 mRNA. Here we report that the murine ribozyme modulates its own host mRNA maturation in both cultured cortical neurons and the hippocampus. Inhibition of the ribozyme using an antisense oligonucleotide leads to increased CPEB3 protein expression, which enhances polyadenylation and translation of localized plasticity-related target mRNAs, and subsequently strengthens hippocampal-dependent long-term memory. These findings reveal a previously unknown role for self-cleaving ribozyme activity in regulating experience-induced co-transcriptional and local translational processes required for learning and memory.

Abstract C/D box small nucleolar RNAs (snoRNAs) comprise a class of small noncoding RNAs with important regulatory effects on cellular RNA function. Although it is well established that snoRNAs coordinate the post-transcriptional modification of pre-ribosomal and small nuclear RNAs by 2’-O-methylation, which leads to enhanced RNA stability, whether they are necessary for memory-related processes remains relatively unexplored. Using targeted sequencing, we have identified more than 150 C/D box snoRNAs in the prefrontal cortex of male C57BL/6J mice, 31 of which are differentially expressed in response to fear extinction learning. We have also discovered a subset of snoRNAs, including many orphans, that are enriched in the synaptic compartment, including the orphan snoRNA snord64. An extinction learning-induced increase in synapse-enriched snord64 led to increased 2’-O-methylation within the 3-UTR of the mRNA encoding the ubiquitin ligase RNF146. This effect was blocked by snord64 knockdown and was accompanied by attenuated forgetting of conditioned fear and the enhanced retrieval of fear extinction memory. Localized activity of orphan snoRNAs therefore represents a novel mechanism associated with fear-related learning and memory. Significance statement We have discovered a population of experience-dependent small nucleolar RNAs (snoRNAs), and found that several of these are recruited to the synaptic compartment in response to fear extinction learning. In particular, the orphan snoRNA, snord64, drives the methylation of the mRNA encoding the ubiquitin ligase, RNF146, with a reduction in snord64 attenuating forgetting of conditioned fear and enhancing the retrieval of fear extinction memory. This study reveals a new mechanism of gene regulation associated with fear-related memory that involves the activity of synapse-enriched snoRNAs.

Abstract Circular RNAs (circRNAs) comprise a novel class of regulatory RNAs that are abundant in the brain, particularly within synapses. They are highly stable, dynamically regulated, and display a range of functional roles, including as decoys for miRNAs and proteins and, in some cases, translation. Early work in animal models revealed an association between circRNAs and neurodegenerative and neuropsychiatric disorders; however, relatively few studies have shown a causal link between circRNA function and memory. To address this knowledge gap, we sequenced circRNAs in the synaptosome compartment of the medial prefrontal cortex of fear extinction trained male C57BL/6J mice and found 12837 circRNAs enriched at the synapse, including Cdr1as . Targeted knockdown of Cdr1as in the neural processes of the infralimbic prefrontal cortex of male C57BL/6J mice led to impaired fear extinction memory. Altogether, our findings highlight the importance of localised circRNA activity at the synapse for memory formation and suggest that circRNAs may have a more widespread effect on brain function than previously thought.

ABSTRACT The RNA modification N6-methyladenosine (m6A) is highly abundant in the human brain and implicated in neuropsychiatric and neurodegenerative disorders. However, most techniques for studying m6A cannot resolve modifications within RNA isoforms and we lack an isoform-level map of m6A sites in the brain. Profiling m6A within isoforms is therefore a critical step towards understanding the complex mechanisms that underpin brain function and disease. Oxford Nanopore direct RNA sequencing (DRS) can quantify isoform expression, modifications and polyA tail lengths, enabling simultaneous investigation of the transcriptome and epitranscriptome. We applied DRS to three post-mortem human brain regions: prefrontal cortex, caudate nucleus and cerebellum. We identified 57,000 m6A sites within 15,000 isoforms and estimated that >27% of mRNA molecules contained an m6A modification. Our results revealed both isoform- and brain-region-specific patterning of m6A modifications and polyA tail lengths. The prefrontal cortex exhibited a distinctive profile of specifically modified isoforms enriched in excitatory neuron cell types and also had the highest proportion of previously unannotated m6A sites. A population of isoforms were hypermodified with m6A and were associated with excitatory neuron cell types in all three brain regions. We also discovered >15k differentially expressed isoforms, >2k differentially modified m6A sites and 566 isoforms with differential polyA lengths between brain regions. Our study demonstrates the utility of DRS for investigating multiple features of RNA isoforms in the brain and provides new insights into brain region specificity and functioning with implications for neurological development and disease.

Epigenetic regulation of activity-induced gene expression involves multiple levels of molecular interaction, including histone and DNA modifications, as well as mechanisms of DNA repair. Here we demonstrate that the genome-wide deposition of Inhibitor of growth family member 1 (ING1), which is a central epigenetic regulatory protein, is dynamically regulated in response to activity in primary cortical neurons. ING1 knockdown leads to decreased expression of genes related to synaptic plasticity, including the regulatory subunit of calcineurin, Ppp3r1. In addition, ING1 binding at a site upstream of the transcription start site (TSS) of Ppp3r1 depends on yet another group of neuroepigenetic regulatory proteins, the Piwi-like family, which are also involved in DNA repair. These findings provide new insight into a novel mode of activity-induced gene expression, which involves the interaction between different epigenetic regulatory mechanisms traditionally associated with gene repression and DNA repair.

Abstract The conformational state of DNA fine-tunes the transcriptional rate and abundance of RNA. Here we report that DNA G-quadruplex (G4-DNA) accumulates in neurons in an experience-dependent manner, and that this is required for the transient silencing and activation of genes that are critically involved in learning and memory. In addition, site-specific resolution of G4-DNA by dCas9-mediated deposition of the helicase DHX36 impairs fear extinction memory. Dynamic DNA structure states therefore represent a key molecular mechanism underlying memory consolidation. One-Sentence Summary G4-DNA is a molecular switch that enables the temporal regulation of the gene expression underlying the formation of fear extinction memory.