Mass spectrometry-based proteomics now enables the absolute quantification of thousands of proteins in individual cell types. We used this technology to analyze the dynamic proteome changes occurring during human erythropoiesis. We quantified the absolute expression of 6,130 proteins during erythroid differentiation from late burst-forming units-erythroid (BFU-Es) to orthochromatic erythroblasts. A modest correlation between mRNA and protein expression was observed. We identified several proteins with unexpected expression patterns in erythroid cells, highlighting a breakpoint in the erythroid differentiation process at the basophilic stage. We also quantified the distribution of proteins between reticulocytes and pyrenocytes after enucleation. These analyses identified proteins that are actively sorted either with the reticulocyte or the pyrenocyte. Our study provides the absolute quantification of protein expression during a complex cellular differentiation process in humans, and it establishes a framework for future studies of disordered erythropoiesis.

Abstract Cancer cells rely on mitochondria for their bioenergetic supply and macromolecule synthesis. Central to mitochondrial function is the regulation of mitochondrial protein synthesis, which primarily depends on the cytoplasmic translation of nuclear-encoded mitochondrial mRNAs whose protein products are imported into mitochondria. Despite the growing evidence that mitochondrial protein synthesis contributes to the onset and progression of cancer, and can thus offer new opportunities for cancer therapy, knowledge of the underlying molecular mechanisms remains limited. Here, we show that RNA G-quadruplexes (RG4s) regulate mitochondrial function by modulating cytoplasmic mRNA translation of nuclear-encoded mitochondrial proteins. Our data support a model whereby the RG4 folding dynamics, under the control of oncogenic signaling and modulated by small molecule ligands or RG4-binding proteins, modifies mitochondria-localized cytoplasmic protein synthesis. Ultimately, this impairs mitochondrial functions, affecting energy metabolism and consequently cancer cell proliferation.

In contrast to mammalian erythroid cells that lost their nucleus at the end of the differentiation process, circulating chicken erythrocytes, like erythrocytes of most other non-mammalian vertebrates, are nucleated although their nucleus is believed to be transcriptionally silent. This major difference suggests that the erythroid differentiation process is likely to present both similarities and differences in mammals compared to other vertebrates. Since proteins are the major cellular effectors, analysis of the proteome is more prone to reflect true differences than analysis of the pattern of mRNA expression. We have previously reported the evolution of the proteome of human erythroid cells throughout their differentiation process. Here we report the analysis of the proteome of chicken erythroblasts during their terminal differentiation. We used the T2EC cellular model that allows to obtain homogenous populations of immature erythroblasts. Induction of their terminal differentiation led to their maturation and the possibility to obtain cells at different differentiation stages. Mass spectrometry analysis of these cell populations allowed the absolute quantification of 6167 proteins throughout the terminal differentiation process. Beside many proteins with similar expression patterns between chicken and human erythroblasts, like SLC4A1 (Band3), GATA1 or CD44, this analysis also revealed that other important proteins like Kit or other GATA transcription factors exhibit fully different patterns of expression.

Embryonic stem cells (ESC) have the unique ability to differentiate into all three germ cell layers. ESC transition through different states of pluripotency in response to growth factor signals and environmental cues before becoming terminally differentiated. Here, we demonstrated, by a multi-omic strategy, that the deubiquitinase USP9X regulates the developmental potential of ESC, and their transition from a naive to a more developmentally advance, or primed, state of pluripotency. We show that USP9X facilitates developmental gene expression and induces modifications of the mitochondrial bioenergetics, including decreased routing of pyruvate towards its oxidation and reduced respiration. In addition, USP9X binds to the pluripotency factor ESRRB, regulates its abundance and the transcriptional levels of a subset of its target genes. Finally, under permissive culture conditions, depletion of Usp9X accelerates cell differentiation in all cell lineages. We thus identified a new regulator of naive pluripotency and show that USP9X couples ESRRB pluripotency transcriptional network and cellular metabolism, both of which are important for ESC fate and pluripotency.

In addition to its canonical role as a regulator of mitochondrial outer membrane permeabilization, BCL-xL exerts diverse non canonical functions contributing to cancer cell aggressiveness. In particular it regulates KRAS intracellular activation levels. We herein explored the mechanistic basis for this effect by a spatially restricted biotin-labelling proteomic approach designed to characterize proteins whose proximity to KRAS, used as a bait, is BCL-xL dependant. BCL-xL loss relocalizes KRAS to the vicinity of mitochondrial proteins. Proximal proteins include the mitochondrial scaffold prohibitin 2 (PHB2), which also interacts with BCL-xL and the downregulation of which prevents BCL-xL sensitive effects of KRAS induced contacts between mitochondria and endosomes, and mitochondrial mass decrease. These results argue that BCL-xL prevents a negative feedback regulation of KRAS canonical signaling by KRAS interference with mitochondrial quality control.