ABSTRACT The end-to-end fusion of enzymes that catalyse successive steps in a reaction pathway is a metabolic engineering strategy that has been successfully applied in a variety of pathways and is particularly common in terpene bioproduction. Despite its popularity, limited work has been done to interrogate the mechanism of metabolic enhancement from enzyme fusion. We observed a remarkable >110-fold improvement in nerolidol production upon translational fusion of nerolidol synthase (a sesquiterpene synthase) to farnesyl diphosphate synthase. This delivered a titre increase from 29.6 mg/L up to 4.2 g/L nerolidol in a single engineering step. Whole-cell proteomic analysis revealed that nerolidol synthase levels in the fusion strains were greatly elevated compared to the non-fusion control. Similarly, the fusion of nerolidol synthase to non-catalytic domains also produced comparable increases in titre, which coincided with improved enzyme expression. When farnesyl diphosphate synthase was fused to other terpene synthases, we observed more modest improvements in terpene titre (1.9- and 3.8-fold), which corresponds to increases of a similar magnitude in terpene synthase expression. Therefore, increased in vivo enzyme levels – resulting from improved expression and/or stability – is likely to be a major driver of catalytic enhancement from enzyme fusion.

Abstract Temperature is an important control factor for biologics biomanufacturing in precision fermentation. Here, we explored a highly responsive low temperature-inducible genetic system (LowTempGAL) in the model yeast Saccharomyces cerevisiae. Two temperature biosensors, a heat-inducible degron and a heat-inducible protein aggregation domain, were used to regulate the GAL activator Gal4p, rendering the leaky LowTempGAL systems. Boolean-type induction was achieved by implementing a second-layer control through low-temperature-mediated repression on GAL repressor gene GAL80, but suffered delayed response to low-temperature triggers and a weak response at 30°C. Application potentials were validated for protein and small molecule production. Proteomics analysis suggested that residual Gal80p and Gal4p insufficiency caused suboptimal induction. ‘Turbo’ mechanisms were engineered through incorporating a basal Gal4p expression and a galactose-independent Gal80p-supressing Gal3p mutant (Gal3Cp). Varying Gal3Cp configurations, we deployed the LowTempGAL systems capable for a rapid stringent high-level induction upon the shift from a high temperature (37–33°C) to a low temperature (≤30°C). Overall, we present a synthetic biology procedure that leverages ‘leaky’ biosensors to deploy highly responsive Boolean-type genetic circuits. The key lies in optimisation of the intricate layout of the multi-factor system. The LowTempGAL systems may be applicable in non-conventional yeast platforms for precision biomanufacturing.

ABSTRACT Enzyme spatial organisation and compartmentalisation are naturally evolved mechanisms for facilitating multi-step biocatalysis. We explored the synthetic in vivo co-encapsulation of two different cargo proteins in yeast using a self-assembling virus-like particle. Co-encapsulation was verified using single particle techniques for both end-to-end fusion of the cargo proteins with the encapsulation anchor at one end, and coexpression of each cargo protein with their individual anchors. The co-encapsulation of a bifunctional geranyl diphosphate/farnesyl diphosphate synthase and a bifunctional linalool/nerolidol synthase delivered nerolidol titres up to 30 times that of an unorganised ‘free’ enzyme control, a remarkable improvement from a single engineering step. Interestingly, striking differences in the ratio of products (linalool and nerolidol) were observed with each spatial organisation approach. This work presents the largest reported titre fold increases from in vivo enzyme compartmentalisation and suggests that enzyme spatial organisation could be used to modulate the product profile of promiscuous enzymes.

In synthetic biology, microbial chasses including yeast Saccharomyces cerevisiae are iteratively engineered with increasing complexity and scale. Wet-lab genetic engineering tools are developed and optimised to facilitate strain construction but are often incompatible with each other due to shared regulatory elements, such as the galactose-inducible (GAL) promoter in S. cerevisiae. Here, we prototyped the cyanamide-induced I-SceI-mediated double-strand DNA breaks (DSBs) for selectable marker recycling in yeast metabolic engineering. We further combined cyanamide-induced I-SceI-mediated DSB and maltose-induced MazF-mediated negative selection for plasmid-free in situ promoter replacement, which simplified the molecular cloning procedure for promoter characterisation in S. cerevisiae. We then characterised three tetracycline-inducible promoters of differential strength, a non-leaky β-estradiol-inducible promoter, cyanamide-inducible DDI2 promoter, bidirectional MAL32/MAL31 promoters, and five pairs of bidirectional GAL1/GAL10 promoters. Overall, alternative regulatory controls for genome engineering tools are important for the construction of complexed genotypes in microbial systems for synthetic biology and metabolic engineering applications.

Abstract Tandem gene repeats naturally occur as important genomic features and determine many traits in living organisms, like human diseases and microbial productivities of target bioproducts. Here, we develop a bacterial type-II toxin-antitoxin-mediated method to manipulate genomic integration of tandem gene repeats in Saccharomyces cerevisiae and further visualise the evolutionary trajectories of gene repeats. We designed a tri-vector system to introduce toxin-antitoxin-driven gene amplification (ToxAmp) modules, and accidentally re-visited the high-level capacity of multi-fragment co-transformation in S. cerevisiae . This system delivered the multi-copy gene integration in the form of tandem gene repeats spontaneously and independently from toxin-antitoxin-mediated selection. Inducing the toxin (RelE) expressing via a copper (II)-inducible CUP1 promoter successfully drove the in-situ gene amplification of the antitoxin (RelB) module, resulting in ∼40 copies of a green fluorescence reporter (GFP) gene per copy of genome. The copy-number changes, increasing and decreasing, and stable maintenance were visualised using the GFP and blue chromoprotein AeBlue as reporters. Copy-number increasing happened spontaneously not depending on a selection pressure and was quickly enriched through toxin-antitoxin-mediated selection. In summary, the bacterial toxin-antitoxin systems provide a flexible mechanism to manipulate gene copy number in eukaryotic cells and can be exploited for synthetic biology and metabolic engineering applications. Table of Contents Graphic