Cultivated bacteria such as actinomycetes are a highly useful source of biomedically important natural products. However, such ‘talented’ producers represent only a minute fraction of the entire, mostly uncultivated, prokaryotic diversity. The uncultured majority is generally perceived as a large, untapped resource of new drug candidates, but so far it is unknown whether taxa containing talented bacteria indeed exist. Here we report the single-cell- and metagenomics-based discovery of such producers. Two phylotypes of the candidate genus ‘Entotheonella’ with genomes of greater than 9 megabases and multiple, distinct biosynthetic gene clusters co-inhabit the chemically and microbially rich marine sponge Theonella swinhoei. Almost all bioactive polyketides and peptides known from this animal were attributed to a single phylotype. ‘Entotheonella’ spp. are widely distributed in sponges and belong to an environmental taxon proposed here as candidate phylum ‘Tectomicrobia’. The pronounced bioactivities and chemical uniqueness of ‘Entotheonella’ compounds provide significant opportunities for ecological studies and drug discovery. Single-cell- and metagenomics-based study reveals two members of the candidate genus ‘Entotheonella’, symbionts of the marine sponge Theonella swinhoei; distinct biosynthetic gene clusters that account for most of the bioactive polyketides and peptides known from T. swinhoei are shown to be attributable to a single member of the T. swinhoei Y microbiome. Almost all drugs and drug candidates from bacteria are produced by a few groups of metabolically rich organisms. That leaves the unculturable — or uncultivated — microbial majority as a largely untapped resource. Here Jörn Piel and colleagues report the use of single-cell and metagenomic analysis to identify two potential 'environmental factories', both members of the candidate genus Entotheonella and symbionts of the chemically rich marine sponge Theonella swinhoei. Importantly they find that the genomes of both microbes encode multiple distinct biosynthetic gene clusters that together account for most of the bioactive polyketides and peptides previously thought to be produced by the sponge host. This discovery identifies Entotheonella and members of the newly proposed phylum Tectomicrobia as a 'biochemically talented' phylum on a par with the actinomycetes.

Bacterial symbionts have long been suspected to be the true producers of many drug candidates isolated from marine invertebrates. Sponges, the most important marine source of biologically active natural products, have been frequently hypothesized to contain compounds of bacterial origin. This symbiont hypothesis, however, remained unproven because of a general inability to cultivate the suspected producers. However, we have recently identified an uncultured Pseudomonas sp. symbiont as the most likely producer of the defensive antitumor polyketide pederin in Paederus fuscipes beetles by cloning the putative biosynthesis genes. Here we report closely related genes isolated from the highly complex metagenome of the marine sponge Theonella swinhoei, which is the source of the onnamides and theopederins, a group of polyketides that structurally resemble pederin. Sequence features of the isolated genes clearly indicate that it belongs to a prokaryotic genome and should be responsible for the biosynthesis of almost the entire portion of the polyketide structure that is correlated with antitumor activity. Besides providing further proof for the role of the related beetle symbiont-derived genes, these findings raise intriguing ecological and evolutionary questions and have important general implications for the sustainable production of otherwise inaccessible marine drugs by using biotechnological strategies.

Made and Modified The polytheonamides are 48-residue toxins derived from marine sponges that include 18 D -amino acids, as well as many other unusual amino acid modifications. Given the complexity, one might guess that these peptides are the product of nonribosomal, peptide synthetase (NRPS). However, Freeman et al. (p. 387 , published online 13 September now show that polytheonamides are produced by a bacterial symbiont using a ribosomal pathway. Six candidate enzymes for the 48 posttranslational modifications were identified and three were functionally validated. Such ribosomal systems could be useful in bioengineering.

ABSTRACT The production of bioactive metabolites is increasingly recognized as an important function of host-associated bacteria. An example is defensive symbiosis that might account for much of the chemical richness of marine invertebrates including sponges (Porifera), one of the oldest metazoans. However, as most complex microbiomes remain largely uncultivated and lack reference genomes, unequivocally linking metabolic functions to a cellular source is a challenge. Here we report an analysis pipeline of microfluidic encapsulation, Raman microscopy, and integrated digital genomics (MERMAID) for an efficient identification of uncultivated producers. We applied this method to the chemically rich bacteriosponge Theonella swinhoei , previously shown to contain ‘Entotheonella’ symbionts providing most of its bioactive substances except for the antifungal aurantosides that lacked biosynthetic gene candidates in the metagenome. Raman-guided single-bacterial analysis and sequencing revealed a cryptic, distinct multiproducer, ‘ Candidatus Poriflexus aureus’ from a new Chloroflexi lineage. Its exceptionally large genome contains numerous biosynthetic loci and suggested an even higher chemical richness of this sponge than previously appreciated. This study highlights the importance of complementary technologies to uncover microbiome functions, reveals remarkable parallels between distantly related symbionts of the same host, and adds functional support for diverse chemically prolific lineages being present in microbial dark matter. Significance Statement The production of bioactive metabolites is increasingly recognized as an important function of host-associated bacteria. However, the acquisition of integrated genomic and metabolic data from uncultivated environmental bacteria is still challenging. In this work, we explored the combination of Raman microscopy and single-cell sequencing to localize chemical features to a specific bacterium in an uncultivated microbiome, and we specified the bacteria in the uncultured lineage as a producer of aurantoside, an antifungal natural product, from a chemically and microbially complex sponge. This study offers a new methodology as well as insights into chemical functions of uncultivated life.

Cyclolithistide A is a peptide lactone isolated from marine lithistid sponges. Its entire structure, including absolute configurations, has been reported except the relative and absolute configurations of its characteristic residue, 4-chloroisoleucine (4-CIle). We synthesized four isomers of 4-CIle from furfural-derived N-Boc imine and propionaldehyde. Analysis of the acid hydrolysate of cyclolithistide A and the synthetic samples of 4-CIle after derivatization with l- and d-FDAA permitted us to propose the absolute configuration of the 4-chloroisoleucine residue in cyclolithistide A as 2S,3R,4R.

Absolute configuration at 12 stereocenters in the 36-membered macrocyclic ring portion of poecillastrin C (

Abstract Numerous biologically active natural products have been discovered from marine sponges, particularly from Theonella swinhoei , which is known to be a prolific source of natural products such as polyketides and peptides. Recent studies have revealed that many of these natural products are biosynthesized by Candidatus Entotheonella phylotypes, which are uncultivated symbionts within T. swinhoei . Consequently, Entotheonella is considered an untapped biochemical resource. In this study, we conducted metagenomic analyses to assess the diversity of Entotheonella in four T. swinhoei individuals (two each of chemotypes Y and W), after separating filamentous bacteria using density gradient centrifugation. We obtained five Entotheonella genomes from filamentous bacteria-enriched fractions. Notably, one of these genomes is significantly different from previously reported Entotheonella variants. Additionally, we identified closely related Entotheonella members present across different chemotypes of T. swinhoei . Thus, our metagenomic insights reveal that the diversity of Entotheonella within Theonella sponges is greater than previously recognized.