Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) is an inherited arrhythmia syndrome that is often difficult to treat. Hiroshi Watanabe and coworkers now show that flecainide, an approved drug known to inhibit sodium channels, is able to target the underlying cause of CPVT by inhibiting calcium release through the ryanodine receptor. Flecainide prevented arrhythmia in a mouse model of CPVT and was also effective when tested in two individuals with CPVT. Catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT) is a potentially lethal inherited arrhythmia syndrome in which drug therapy is often ineffective. We discovered that flecainide prevents arrhythmias in a mouse model of CPVT by inhibiting cardiac ryanodine receptor–mediated Ca2+ release and thereby directly targeting the underlying molecular defect. Flecainide completely prevented CPVT in two human subjects who had remained highly symptomatic on conventional drug therapy, indicating that this currently available drug is a promising mechanism-based therapy for CPVT.

Cardiac calsequestrin (Casq2) is thought to be the key sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ storage protein essential for SR Ca2+ release in mammalian heart. Human CASQ2 mutations are associated with catecholaminergic ventricular tachycardia. However, homozygous mutation carriers presumably lacking functional Casq2 display surprisingly normal cardiac contractility. Here we show that Casq2-null mice are viable and display normal SR Ca2+ release and contractile function under basal conditions. The mice exhibited striking increases in SR volume and near absence of the Casq2-binding proteins triadin-1 and junctin; upregulation of other Ca2+-binding proteins was not apparent. Exposure to catecholamines in Casq2-null myocytes caused increased diastolic SR Ca2+ leak, resulting in premature spontaneous SR Ca2+ releases and triggered beats. In vivo, Casq2-null mice phenocopied the human arrhythmias. Thus, while the unique molecular and anatomic adaptive response to Casq2 deletion maintains functional SR Ca2+ storage, lack of Casq2 also causes increased diastolic SR Ca2+ leak, rendering Casq2-null mice susceptible to catecholaminergic ventricular arrhythmias.

This study evaluated the efficacy and safety of flecainide in addition to conventional drug therapy in patients with catecholaminergic polymorphic ventricular tachycardia (CPVT). CPVT is an inherited arrhythmia syndrome caused by gene mutations that destabilize cardiac ryanodine receptor Ca2+ release channels. Sudden cardiac death is incompletely prevented by conventional drug therapy with β-blockers with or without Ca2+ channel blockers. The antiarrhythmic agent flecainide directly targets the molecular defect in CPVT by inhibiting premature Ca2+ release and triggered beats in vitro. We collected data from every consecutive genotype-positive CPVT patient started on flecainide at 8 international centers before December 2009. The primary outcome measure was the reduction of ventricular arrhythmias during exercise testing. Thirty-three patients received flecainide because of exercise-induced ventricular arrhythmias despite conventional (for different reasons, not always optimal) therapy (median age 25 years; range 7 to 68 years; 73% female). Exercise tests comparing flecainide in addition to conventional therapy with conventional therapy alone were available for 29 patients. Twenty-two patients (76%) had either partial (n = 8) or complete (n = 14) suppression of exercise-induced ventricular arrhythmias with flecainide (p < 0.001). No patient experienced worsening of exercise-induced ventricular arrhythmias. The median daily flecainide dose in responders was 150 mg (range 100 to 300 mg). During a median follow-up of 20 months (range 12 to 40 months), 1 patient experienced implantable cardioverter-defibrillator shocks for polymorphic ventricular arrhythmias, which were associated with a low serum flecainide level. In 1 patient, flecainide successfully suppressed exercise-induced ventricular arrhythmias for 29 years. Flecainide reduced exercise-induced ventricular arrhythmias in patients with CPVT not controlled by conventional drug therapy.

Human-induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hiPSC-CM) are increasingly being used for modeling heart disease and are under development for regeneration of the injured heart. However, incomplete structural and functional maturation of hiPSC-CM, including lack of T-tubules, immature excitation-contraction coupling, and inefficient Ca-induced Ca release remain major limitations.Thyroid and glucocorticoid hormones are critical for heart maturation. We hypothesized that their addition to standard protocols would promote T-tubule development and mature excitation-contraction coupling of hiPSC-CM when cultured on extracellular matrix with physiological stiffness (Matrigel mattress).hiPSC-CM were generated using a standard chemical differentiation method supplemented with T3 (triiodothyronine) and/or Dex (dexamethasone) during days 16 to 30 followed by single-cell culture for 5 days on Matrigel mattress. hiPSC-CM treated with T3+Dex, but not with either T3 or Dex alone, developed an extensive T-tubule network. Notably, Matrigel mattress was necessary for T-tubule formation. Compared with adult human ventricular cardiomyocytes, T-tubules in T3+Dex-treated hiPSC-CM were less organized and had more longitudinal elements. Confocal line scans demonstrated spatially and temporally uniform Ca release that is characteristic of excitation-contraction coupling in the heart ventricle. T3+Dex enhanced elementary Ca release measured by Ca sparks and promoted RyR2 (ryanodine receptor) structural organization. Simultaneous measurements of L-type Ca current and intracellular Ca release confirmed enhanced functional coupling between L-type Ca channels and RyR2 in T3+Dex-treated cells.Our results suggest a permissive role of combined thyroid and glucocorticoid hormones during the cardiac differentiation process, which when coupled with further maturation on Matrigel mattress, is sufficient for T-tubule development, enhanced Ca-induced Ca release, and more ventricular-like excitation-contraction coupling. This new hormone maturation method could advance the use of hiPSC-CM for disease modeling and cell-based therapy.

Abstract Background Engraftment arrhythmias (EAs) are observed in large animal studies of intramyocardial transplantation of human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes (hPSC-CMs) for myocardial infarction. Although transient, the risk posed by EA presents a barrier to clinical translation. Objectives We hypothesized that clinically approved antiarrhythmic drugs can prevent EA-related mortality as well as suppress tachycardia and arrhythmia burden. Methods hPSC-CM were transplanted into the infarcted porcine heart by surgical or percutaneous delivery to induce EA. Following a screen of antiarrhythmic agents, a prospective study was conducted to determine the effectiveness of amiodarone plus ivabradine in preventing cardiac death and suppressing EA. Results EA was observed in all subjects, and amiodarone-ivabradine treatment was well-tolerated. None of the treated subjects experienced the primary endpoint of cardiac death, unstable EA or heart failure compared to 5/8 (62.5%) in the control cohort (hazard ratio 0.00; 95% confidence interval, 0–0.297; p = 0.002). Overall survival including two deaths in the treated cohort from immunosuppression-related infection showed borderline improvement with treatment (hazard ratio 0.21; 95% confidence interval, 0.03–1.01; p = 0.05). Without treatment, peak heart rate averaged 305 ± 29 beats per min (bpm), whereas in treated subjects peak daily heart rate was significantly restricted to 185±9 bpm (p = 0.006). Similarly, treatment reduced peak daily EA burden from 96.8 ± 2.9% to 76.5 ± 7.9% (p = 0.003). Antiarrhythmic treatment was safely discontinued after approximately one-month of treatment without recrudescence of arrhythmia. Conclusions The risk of engraftment arrhythmia following hPSC-CM transplantation can be reduced significantly by combined amiodarone and ivabradine drug therapy. Condensed Abstract Engraftment arrhythmia (EA) is a transient but serious complication of cardiac remuscularization therapy. Using a porcine model of cardiac remuscularization and EA, ivabradine and amiodarone were independently effective in suppressing tachycardia and arrhythmia, respectively. Baseline amiodarone combined with adjunctive ivabradine successfully prevented cardiac death, unstable EA and heart failure (hazard ratio 0.00; 95% confidence interval, 0–0.297; p = 0.002) and significantly suppressed peak daily heart rate and arrhythmia burden (p=0.006 and 0.003, respectively). Antiarrhythmic treatment was successfully discontinued after one-month without recrudescence of arrhythmia. We conclude that EA can be suppressed by combined amiodarone and ivabradine drug therapy.

Cyclic oligomeric depsipeptides (COD) are a structural class within naturally occurring compounds with a wide range of biological activity. Verticilide is a COD (24-membered ring) that was identified by its inhibition of insect ryanodine receptor (RyR). We have since found that the enantiomer of verticilide (

Abstract Background Ventricular tachycardia (VT) is responsible for sudden death in chronic ischemic heart disease (CIHD) patients. The cardiac ryanodine receptor (RyR2) releases Ca2+ from the sarcoplasmic reticulum (SR) and links electrical excitation to contraction. RyR2 hyperactivity has been widely documented in CIHD and may contribute to VT risk and progressive LV remodeling. Objective To test the hypothesis that targeting RyR2 hyperactivity plays a mechanistic role in VT inducibility and progressive heart failure in CIHD that can be prevented by the RyR2 inhibitor dantrolene. Methods CIHD was induced in C57BL/6J mice by left coronary artery ligation. Four weeks later, mice were randomized to either acute or chronic (6 weeks via osmotic mini-pump) treatment with dantrolene or vehicle. VT inducibility was assessed by programmed stimulation in vivo and in isolated hearts. Electrical substrate remodeling was assessed by optical mapping. Ca2+ sparks and spontaneous Ca2+ releases were measured in isolated cardiomyocytes. Cardiac remodeling was assessed by histology and qRT-PCR. Cardiac function and contractility were assessed by echocardiography. Results Compared to vehicle, acute dantrolene treatment reduced VT inducibility and improved LV contractility in vivo . Optical mapping in isolated hearts demonstrated reentrant VT prevention by dantrolene, which normalized the shortened refractory period (VERP) and prolonged action potential duration (APD), preventing APD alternans. In single CIHD cardiomyocytes, dantrolene normalized RyR2 hyperactivity and prevented spontaneous SR Ca 2+ release. Chronic dantrolene treatment reduced peripheral muscle strength but had no adverse effects on body weight or mortality. Chronic dantrolene not only reduced VT inducibility but also reduced peri-infarct fibrosis and prevented the progression of LV dysfunction in CIHD mice. Conclusion RyR2 hyperactivity plays a mechanistic role for VT risk, infarct remodeling, and contractile dysfunction in CIHD mice. Our data provide proof of concept for the anti-arrhythmic and anti-fibrotic efficacy of dantrolene in CIHD. Clinical Perspective What is New? The mouse CIHD model is a more clinically relevant model in which treatment is started late after infarction, when heart failure is already established. Acute and chronic dantrolene treatment suppresses VT inducibility by restoring myocyte APD, terminating APD alternans and normalizing VERP. Chronic dantrolene treatment prevents pathological remodeling and peri-infarct fibrosis, the substrate for reentry VT. Cardiac function is improved with chronic dantrolene therapy. Clinical Implications Treatment with dantrolene, which is already approved for clinical use, is a promising therapy in patients with ischemic heart disease, in whom other antiarrhythmic drugs are contraindicated. Dantrolene inhibition of RyR2 not only suppresses VT but also improves cardiac function in chronic ischemic heart disease.

ABSTRACT Background KCHN2 encodes the K V 11.1 potassium channel responsible for I Kr , a major repolarization current during the cardiomyocyte action potential. Variants in KCNH2 that decrease I Kr can cause Type 2 Long QT syndrome, usually due to mistrafficking to the cell surface. Accurately discriminating between variants with normal and abnormal trafficking would help clinicians identify and treat individuals at risk of a major cardiac event. The volume of reported non-synonymous KCNH2 variants preclude the use of conventional electrophysiologic methods for functional study. Objective To report a high-throughput, multiplexed screening method for KCNH2 genetic variants capable of measuring the cell surface abundance of hundreds of missense variants in KCNH2 . Methods We develop a method to quantitate KCNH2 variant trafficking on a pilot region of 11 residues in the S5 helix, and generate trafficking scores for 220/231 missense variants in this region. Results For 5/5 variants, high-throughput trafficking scores validated when tested in single variant flow cytometry and confocal microscopy experiments. We additionally compare our results with planar patch electrophysiology and find that loss-of-trafficking variants do not produce I Kr , but that some variants which traffic normally may still be functionally compromised. Conclusions Here, we describe a new method for detecting trafficking-deficient variants in KCNH2 in a multiplexed assay. This new method accurately generates trafficking data for variants in KCNH2 and can be readily extended to all residues in Kv11.1 and to other cell surface proteins. CLINICAL IMPLICATIONS Hundreds of KCNH2 variants have been observed to date, and thousands more will be found as clinical and population sequencing efforts become increasingly widespread. The major mechanism of K V 11.1 loss of function is misfolding and failure to traffic to the cell surface. Deep mutational scanning of KCNH2 trafficking is a scalable, high-throughput method that can help identify new loss of function variants and decipher the large number of KCNH2 variants being found in the population.

Background: TANGO2 deficiency disease (TDD), caused by a homozygous large deletion in the Tango2 gene, is associated with impaired fatty acid oxidation-triggered metabolic crises, which can include severe QT prolongation and ventricular arrhythmias. The mechanism of transient QT prolongation and arrhythmias is unknown. Here we test the hypothesis that activation of the nonselective cation channel TRPM4, regulated by intracellular ATP and Ca, contributes mechanistically to arrhythmia risk in TDD. Methods: CRISPR/Cas9 was used to generate a human induced pluripotent stem cell cardiomyocyte (hiPSC-CM) model with a Tango 2 exon 3 to 9 deletion ( Tango2 -/- ). Mitochondrial oxygen consumption rate (OCR), intracellular ATP/ADP ratios, and action potentials (APs) were evaluated in Tango2 -/- hiPSC-CMs under metabolic conditions fueled by either 5.6 mmol/L glucose or 0.1 mmol/L palmitate. Results: Analogous to clinical TDD, Tango2 -/- hiPSC-CMs showed a significant decrease in palmitate-dependent OCR and a profound reduction in intracellular ATP production when palmitate was the sole substrate, worsened after 24-hour fasting. In contrast, when glucose was the only energy source, Tango2 -/- hiPSC-CMs demonstrated OCR and ATP production rates comparable to control. These observations suggest dysfunction in mitochondrial palmitate oxidation leading to energy deficiency in Tango2 -/- hiPSC-CMs, which subsequently result in prolongation of AP duration. Intracellular delivery of Mg-ATP normalized palmitate-induced AP prolongation in Tango2 -/- hiPSC-CMs post fasting. Additionally, although no alterations in L-type Ca current were found, L-type Ca channel inhibition with verapamil alleviated palmitate-induced AP prolongation in Tango2 -/- hiPSC-CMs post fasting by stabilizing ATP/ADP ratios and ameliorating intracellular calcium dysregulation. We found post-fasting exposure to palmitate upregulated Trpm4 gene expression in Tango2 -/- hiPSC-CMs. Targeted genetic knockdown or pharmacological blockade of TRPM4 channels normalized AP prolongation in Tango2 -/- hiPSC-CMs. Conclusion: Our findings established a mechanistic link between myocardial energy deficiency, TRPM4 activation and the development of AP prolongation in TDD, emphasizing the energetic basis of arrhythmias. Targeting TRPM4 is a promising new therapeutic strategy to prevent QT prolongation and arrhythmia in TDD.

Abstract Hyperactivity of cardiac sarcoplasmic reticulum (SR) ryanodine receptor (RyR2) Ca 2+ -release channels contributes to heart failure and arrhythmias. Reducing RyR2 activity, particularly during cardiac relaxation (diastole), is a desirable therapeutic goal. We previously reported that the unnatural enantiomer ( ent ) of an insect-RyR activator, verticilide, inhibits porcine and mouse RyR2 at diastolic (nanomolar) Ca 2+ and has in vivo efficacy against atrial and ventricular arrhythmia. To determine the ent -verticilide structural mode of action on RyR2 and guide its further development via medicinal chemistry structure-activity relationship studies, here we used fluorescence lifetime (FLT)-measurements of Förster resonance energy transfer (FRET) in HEK293 cells expressing human RyR2. For these studies, we used an RyR-specific FRET molecular-toolkit and computational methods for trilateration (i.e., using distances to locate a point of interest). Multi-exponential analysis of FLT-FRET measurements between four donor-labeled FKBP12.6 variants and acceptor-labeled ent -verticilide, yielded distance relationships placing the acceptor probe at two candidate loci within the RyR2 cryo-EM map. One locus is within the Ry12 domain (at the corner periphery of the RyR2 tetrameric complex). The other locus is sandwiched at the interface between helical domain 1 and the SPRY3 domain. These findings document RyR2-target engagement by ent -verticilide, reveal new insight into the mechanism of action of this new class of RyR2-targeting drug candidate, and can serve as input in future computational determinations of the ent -verticilide binding site on RyR2 that will inform structure-activity studies for lead optimization.