The voltage-dependent anion channel (VDAC) of the outer mitochondrial membrane mediates metabolic flow, Ca(2+), and cell death signaling between the endoplasmic reticulum (ER) and mitochondrial networks. We demonstrate that VDAC1 is physically linked to the endoplasmic reticulum Ca(2+)-release channel inositol 1,4,5-trisphosphate receptor (IP(3)R) through the molecular chaperone glucose-regulated protein 75 (grp75). Functional interaction between the channels was shown by the recombinant expression of the ligand-binding domain of the IP(3)R on the ER or mitochondrial surface, which directly enhanced Ca(2+) accumulation in mitochondria. Knockdown of grp75 abolished the stimulatory effect, highlighting chaperone-mediated conformational coupling between the IP(3)R and the mitochondrial Ca(2+) uptake machinery. Because organelle Ca(2+) homeostasis influences fundamentally cellular functions and death signaling, the central location of grp75 may represent an important control point of cell fate and pathogenesis.

Macroautophagy is an evolutionary conserved lysosomal pathway involved in the turnover of cellular macromolecules and organelles. In spite of its essential role in tissue homeostasis, the molecular mechanisms regulating mammalian macroautophagy are poorly understood. Here, we demonstrate that a rise in the free cytosolic calcium ([Ca(2+)](c)) is a potent inducer of macroautophagy. Various Ca(2+) mobilizing agents (vitamin D(3) compounds, ionomycin, ATP, and thapsigargin) inhibit the activity of mammalian target of rapamycin, a negative regulator of macroautophagy, and induce massive accumulation of autophagosomes in a Beclin 1- and Atg7-dependent manner. This process is mediated by Ca(2+)/calmodulin-dependent kinase kinase-beta and AMP-activated protein kinase and inhibited by ectopic Bcl-2 located in the endoplasmatic reticulum (ER), where it lowers the [Ca(2+)](ER) and attenuates agonist-induced Ca(2+) fluxes. Thus, an increase in the [Ca(2+)](c) serves as a potent inducer of macroautophagy and as a target for the antiautophagy action of ER-located Bcl-2.

A better understanding of the mechanisms through which anticancer drugs exert their effects is essential to improve combination therapies. While studying how genotoxic stress kills cancer cells, we discovered a large ∼2MDa cell death-inducing platform, referred to as “Ripoptosome.” It contains the core components RIP1, FADD, and caspase-8, and assembles in response to genotoxic stress-induced depletion of XIAP, cIAP1 and cIAP2. Importantly, it forms independently of TNF, CD95L/FASL, TRAIL, death-receptors, and mitochondrial pathways. It also forms upon Smac-mimetic (SM) treatment without involvement of autocrine TNF. Ripoptosome assembly requires RIP1's kinase activity and can stimulate caspase-8-mediated apoptosis as well as caspase-independent necrosis. It is negatively regulated by FLIP, cIAP1, cIAP2, and XIAP. Mechanistically, IAPs target components of this complex for ubiquitylation and inactivation. Moreover, we find that etoposide-stimulated Ripoptosome formation converts proinflammatory cytokines into prodeath signals. Together, our observations shed new light on fundamental mechanisms by which chemotherapeutics may kill cancer cells.

Abstract Children born with deleterious biallelic variants of the chaperone aryl hydrocarbon receptor interacting protein (AIP) have a novel pediatric metabolic disease presenting a severe, complex clinical phenotype characterized by failure to develop following birth. Analysis of Aip knockout mouse embryonic fibroblasts and patient-derived dermal fibroblasts revealed that AIP was required to support proteostasis; including proteasome activity, induction of autophagy and lysosome function. aip knockout zebrafish, recapitulated the phenotype of the children; dying at an early stage of development when autophagy is required to adapt to periods of starvation. Our results demonstrate that AIP plays a crucial role in initiating autophagy and maintaining proteostasis in vitro and in vivo . One Sentence Summary Homozygous loss of the chaperone AIP results in a novel pediatric disease exhibiting multiple features of a lysosomal storage disease.

Summary Mutations in mitochondrial DNA cause severe multisystem disease, frequently associated with muscle weakness. The m.3243A>G mutation is the major cause of Mitochondrial Encephalomyopathy Lactic Acidosis and Stroke Like episodes (MELAS). Experimental models that recapitulate the disease phenotype in vitro for disease modelling or drug screening are very limited. We have therefore generated hiPSC-derived muscle fibres with variable heteroplasmic mtDNA mutation load without significantly affecting muscle differentiation potential. The cells are excitable and show physiological characteristics of muscle fibres and show well organised myofibrillar structure. In cells carrying the m.3243A>G, the mitochondrial membrane potential and oxygen consumption were reduced in relation to the mutant load. We have shown through proteomic, phosphoproteomic, and metabolomic analyses that the m.3243A>G mutation variably affects the cell phenotype in relation to the mutant load. This variation is reflected by an increase in the NADH/NAD + ratio, which in turns influences key nutrient-sensing pathways in the myofibres. This model enables detailed study of the impact of the mutation on cellular bioenergetics and on muscle physiology with the potential to provide a platform for drug screening.

The IκB kinase ε (IKKε) is a key molecule at the crossroads of inflammation and cancer. Known for its role as an activator of NFκB and IRF3 signalling leading to cytokine secretion, the kinase is also a breast cancer oncogene, overexpressed in a variety of tumours. However, to what extent IKKε remodels cellular metabolism is currently unknown. Here we used a combination of metabolomics and phosphoproteomics to show that IKKε orchestrates a complex metabolic reprogramming that affects mitochondrial metabolism and serine biosynthesis. Acting independently of its canonical signalling role, IKKε upregulates the serine biosynthesis pathway (SBP) mainly by limiting glucose and pyruvate derived anaplerosis of the TCA cycle. In turn, this elicits activation of the transcription factor ATF4 and upregulation of the SBP genes. Importantly, pharmacological inhibition of the IKKε-induced metabolic phenotype reduces proliferation of breast cancer cells. Finally, we show that in a set of basal ER negative and highly proliferative human breast cancer tumours, IKKε and PSAT1 expression levels are positively correlated corroborating the link between IKKε and the SBP in the clinical context.

Abstract Fibrosis is a chronic disease characterized by excessive extracellular matrix (ECM) production which leads to destruction of normal tissue architecture and disruption of organ function. Fibroblasts are key effector cells of this process and respond to a host of pro-fibrotic stimuli, including notably the pleiotropic cytokine, TGF-β 1 , which promotes fibroblast to myofibroblast differentiation. This is accompanied by the simultaneous rewiring of metabolic networks to meet the biosynthetic and bioenergetic needs of contractile and ECM-synthesizing cells, but the exact mechanisms involved remain poorly understood. In this study, we report that extracellular nutrient availability profoundly influences the TGF-β 1 transcriptome of primary human lung fibroblasts (pHLFs) and the “biosynthesis of amino acids” emerges as a top enriched transcriptional module influenced by TGF-β 1 . We subsequently uncover a key role for pyruvate in influencing the pharmacological impact of glutaminase (GLS1) inhibition during TGF-β 1 -induced fibrogenesis. In pyruvate replete conditions which mimic the physiological concentration of pyruvate in human blood, GLS1 inhibition is ineffective in blocking TGF-β 1 -induced fibrogenesis, as pyruvate is able to be used as the substrate for glutamate and alanine production via glutamate dehydrogenase (GDH) and glutamic-pyruvic transaminase 2 (GPT2), respectively. We further show that dual targeting of either GPT2 or GDH in combination with GLS1-inhibition is required to fully block TGF-β 1 -induced collagen synthesis. These findings embolden a therapeutic strategy aimed at additional targeting of mitochondrial pyruvate metabolism in the presence of a glutaminolysis inhibitor in order to interfere with the pathological deposition of collagen in the setting of pulmonary fibrosis and potentially other fibrotic conditions.