Resident dendritic cells (DC) within the T cell area of the lymph node take up soluble antigens that enter via the afferent lymphatics before antigen carrying DC arrive from the periphery. The reticular network within the lymph node is a conduit system forming the infrastructure for the fast delivery of soluble substances from the afferent lymph to the lumen of high endothelial venules (HEVs). Using high-resolution light microscopy and 3D reconstruction, we show here that these conduits are unique basement membrane-like structures ensheathed by fibroblastic reticular cells with occasional resident DC embedded within this cell layer. Conduit-associated DC are capable of taking up and processing soluble antigens transported within the conduits, whereas immigrated mature DC occur remote from the reticular fibers. The conduit system is, therefore, not a closed compartment that shuttles substances through the lymph node but represents the morphological equivalent to the filtering function of the lymph node.

Latent transforming growth factor β-binding protein 1 (LTBP-1) targets latent complexes of transforming growth factor β to the extracellular matrix, where the latent cytokine is subsequently activated by several different mechanisms. Fibrillins are extracellular matrix macromolecules whose primary function is architectural: fibrillins assemble into ultrastructurally distinct microfibrils that are ubiquitous in the connective tissue space. LTBPs and fibrillins are highly homologous molecules, and colocalization in the matrix of cultured cells has been reported. To address whether LTBP-1 functions architecturally like fibrillins, microfibrils were extracted from tissues and analyzed immunochemically. In addition, binding studies were conducted to determine whether LTBP-1 interacts with fibrillins. LTBP-1 was not detected in extracted beaded-string microfibrils, suggesting that LTBP-1 is not an integral structural component of microfibrils. However, binding studies demonstrated interactions between LTBP-1 and fibrillins. The binding site was within three domains of the LTBP-1 C terminus, and in fibrillin-1 the site was defined within four domains near the N terminus. Immunolocalization data were consistent with the hypothesis that LTBP-1 is a fibrillin-associated protein present in certain tissues but not in others. In tissues where LTBP-1 is not expressed, LTBP-4 may substitute for LTBP-1, because the C-terminal end of LTBP-4 binds equally well to fibrillin. A model depicting the relationship between LTBP-1 and fibrillin microfibrils is proposed.

Recombinant mouse nidogen and two fragments were produced in mammalian cells and purified from culture medium without resorting to denaturing conditions. The truncated products were fragments Nd-I (positions 1-905) comprising the N-terminal globule and rod-like domain and Nd-II corresponding mainly to the C-terminal globule (position 906-1217). Recombinant nidogen was indistinguishable from authentic nidogen obtained by guanidine dissociation from tumor tissue with respect to size, N-terminal sequence, CD spectra and immunochemical properties. They differed in protease stability and shape indicating that the N-terminal domain of the more native, recombinant protein consists of two globules connected by a flexible segment. This established a new model for the shape of nidogen consisting of three globes of variable mass (31-56 kDa) connected by either a rod-like or a thin segment. Recombinant nidogen formed stable complexes (Kd less than or equal to 1 nM) with laminin and collagen IV in binding assays with soluble and immobilized ligands and as shown by electron microscopy. Inhibition assays demonstrated different binding sites on nidogen for both ligands with different specificities. This was confirmed in studies with fragment Nd-I binding to collagen IV and fragment Nd-II binding to laminin fragment P1. In addition, recombinant nidogen but not Nd-I was able to bridge between laminin or P1 and collagen IV. Formation of such ternary complexes implicates a similar role for nidogen in the supramolecular organization of basement membranes.

Abstract The embryonic extracellular matrix (ECM) undergoes transition to mature ECM as development progresses, yet specific transition mechanisms ensuring ECM proteostasis and their regulatory impact are poorly defined. Fibrillin microfibrils are macromolecular ECM complexes serving structural and regulatory roles. In mice, Fbn1 and Fbn2, encoding major microfibrillar components, are strongly expressed during embryogenesis, but fibrillin-1 is the major component observed in adult tissue microfibrils. Here, analysis of mouse Adamts6 and Adamts10 mutant embryos, lacking these homologous secreted metalloproteases individually and in combination, along with in vitro analysis of microfibrils, measurement of ADAMTS6-fibrillin affinities and N-terminomics identification of ADAMTS6-cleaved sites, demonstrates a transcriptionally adapted system for fibrillin-2 proteolysis that contributes to postnatal fibrillin-1 dominance. The lack of ADAMTS6, alone and in combination with ADAMTS10 led to excess fibrillin-2 in perichondrium, with impaired skeletal development resulting from a drastic reduction of aggrecan, cartilage link protein and impaired BMP, but not TGFβ signaling in cartilage. Although ADAMTS6 cleaves fibrillin-1 and fibrillin-2 as well as fibronectin, which provides the initial scaffold for microfibril assembly, primacy of the protease-substrate relationship between ADAMTS6 and fibrillin-2 was unequivocally established by reversal of these defects in Adamts6 -/- embryos by genetic reduction of Fbn2 , but not Fbn1 .

Abstract Fibronectin (FN) is an extracellular matrix glycoprotein essential for the development and function of major vertebrate organ systems. Mutations in FN result in an autosomal dominant skeletal dysplasia termed corner fracture-type spondylometaphyseal dysplasia (SMDCF). The precise pathomechanisms through which mutant FN induces impaired skeletal development remain elusive. Here, we have generated patient-derived induced pluripotent stem cells as a cell culture model for SMDCF to investigate the consequences of FN mutations on mesenchymal stem cells (MSCs) and their differentiation into cartilage-producing chondrocytes. In line with our previous data, FN mutations disrupted protein secretion from MSCs, causing a notable increase in intracellular FN and a significant decrease in extracellular FN levels. Analyses of plasma samples from SMDCF patients also showed reduced FN in circulation. FN and endoplasmic reticulum (ER) protein folding chaperones (BIP, HSP47) accumulated in MSCs within ribosome-covered cytosolic vesicles that emerged from the ER and transitioned into lysosomes. Massive amounts of these vesicles were not cleared from the cytosol. The accumulation of intracellular FN and ER proteins elevated cellular stress markers and altered mitochondrial structure. Bulk RNA sequencing revealed a specific transcriptomic dysregulation of the patient-derived cells relative to controls. Analysis of MSC differentiation into chondrocytes showed impaired mesenchymal condensation, reduced chondrogenic markers, and compromised cell proliferation in mutant cells. FN mutant cells also displayed altered FN splice variants under chondrogenic stimuli. Moreover, FN mutant cells exhibited significantly lower transforming growth factor beta-1 (TGFβ1) expression, crucial for mesenchymal condensation. Exogenous FN or TGFβ1 supplementation effectively improved the MSC condensation and promoted chondrogenesis in FN mutant cells. These findings demonstrate the cellular consequences of FN mutations in SMDCF and explain the molecular pathways involved in the associated altered chondrogenesis. Significance /Highlights • SMDCF-causing mutations in fibronectin impair protein secretion in iPSC-derived mesenchymal stem cells. • Mutant fibronectin and ER protein folding chaperones are directly exported from the rough endoplasmic reticulum into vesicles covered with ribosomes, which transition into lysosomes. • The cells cannot clear the massive accumulation of cytosolic vesicles. • Mutations in fibronectin impair stem cell proliferation, mesenchymal condensation, and the differentiation of MSCs into chondrocytes. • Exogenous addition of purified fibronectin or TGFβ-1 improves mesenchymal condensation and chondrogenesis of the FN mutant stem cells.

Fibronectin (FN) is a ubiquitous extracellular matrix glycoprotein essential for the development of various tissues. Mutations in FN cause a unique form of spondylometaphyseal dysplasia, emphasizing its importance in cartilage and bone development. However, the relevance and functional role of FN during skeletal development has remained elusive. To address these aspects, we have generated conditional knockout mouse models targeting the cellular FN isoform in cartilage (cFNKO), the plasma FN isoform in hepatocytes (pFNKO), and both isoforms together in a double knockout (FNdKO). We used these mice to determine the relevance of the two principal FN isoforms in skeletal development from P1 to the adult stage at two months. We identified a distinct topological FN deposition pattern in the mouse limb during different gestational and postnatal skeletal development phases, with prominent levels at the resting and hypertrophic chondrocyte zones and in the trabecular bone. Cartilage-specific cFN emerged as the predominant isoform in the growth plate, whereas circulating pFN remained excluded from the growth plate and confined to the primary and secondary ossification centers. Deleting either isoform independently (cFNKO or pFNKO) yielded only relatively subtle changes in the analyzed skeletal parameters. However, the double knockout of cFN in the growth plate and pFN in the circulation of the FNdKO mice significantly reduced postnatal body weight, body length, and bone length. Micro-CT analysis of the adult bone microarchitecture in FNdKO mice exposed substantial reductions in trabecular bone parameters and bone mineral density. The mice also showed elevated bone marrow adiposity. Analysis of chondrogenesis in FNdKO mice demonstrated changes in the resting, proliferating and hypertrophic growth plate zones, consistent alterations in chondrogenic markers such as collagen type II and X, decreased apoptosis of hypertrophic chondrocytes, and downregulation of bone formation markers. Transforming growth factor-β1 and downstream phospho-AKT levels were significantly lower in the FNdKO than in the control mice, revealing a crucial FN-mediated regulatory pathway in chondrogenesis and bone formation. In conclusion, the data demonstrate that FN is essential for chondrogenesis and bone development. Even though cFN and pFN act in different regions of the bone, both FN isoforms are required for the regulation of chondrogenesis, cartilage maturation, trabecular bone formation, and overall skeletal growth.

Introduction and Purpose Mouse mesenchymal stem cells (MSCs) provide a resourceful tool to study physiological and pathological aspects of adipogenesis. Bone marrow-derived MSCs (BM-MSCs) and adipose tissue-derived MSCs (ASCs) are widely used for these studies. Since there is a wide spectrum of methods available, the purpose is to provide a focused hands-on procedural guide for isolation and characterization of murine BM-MSCs and ASCs and to effectively differentiate them into adipocytes.

Abstract During development, amniote vertebrate embryos transform from a flat, multi-layered sheet into a three-dimensional cylindrical form, through ventral folding of the lateral sides of the sheet (the lateral plate, LP) and their fusion in the ventral midline. Although this basic aspect of vertebrate body plan formation has long been described, it is not understood at the mechanistic level. Each side of the LP is comprised of two tissue layers: a dorsal somatopleure (Sop) of pseudostratified coelomic epithelium, extracellular matrix (ECM) and ectoderm, and a ventral splanchnopleure (Spl) of similar construction except with endoderm instead of ectoderm. Using a chick embryo slice system we find that the flat stage is actually a poised balance of opposing elastic bending tensions, with dorsal bending tension in the Sop opposing ventral bending tension in the Spl. An intact extracellular matrix is required for generating the bending tensions, as localized enzymatic digestion of Sop or Spl ECM dissipates tension, while removal of the endodermal or ectodermal layers has no effect. As development proceeds, the Sop undergoes Epithelial-Mesenchymal Transition, ECM fragmentation and dissipation of dorsal bending tension, while the Spl ECM and ventral bending tension remain intact, thus changing the balance of bending forces in the LP to promote ventral folding. Consistent with these findings, interference with the elastic ECM component fibrillin in the Spl in vivo reduces stored bending tension and perturbs ventral body folding. A generalizable conceptual model is presented in which embryonic growth, in the context of specific embryonic geometrical constraints, leads to accumulation of bending tension in the LP ECM, which is harnessed to drive body folding.

Fibronectin (FN) is a ubiquitous matrix glycoprotein essential for the physiological development of various tissues. Mutations in FN cause a form of skeletal dysplasia, emphasizing the importance of FN in cartilage and bone development. However, the relevance and functional role of FN during skeletal development remains elusive. We employed conditional knockout mouse models for the cellular FN isoform in cartilage (cFNKO), the plasma FN isoform in hepatocytes (pFNKO), and a double knockout (FNdKO) to determine the relevance of these two principal FN isoforms in postnatal skeletal development spanning from P1 to 2 months of age. We identified a unique topological FN deposition pattern in the mouse limb with prominent levels at the resting and hypertrophic chondrocyte zones and in the trabecular bone. Circulating pFN did not enter the growth plate and was limited to the primary ossification center, whereas cartilage-specific cFN was detected as the major isoform in epiphyseal cartilage. Deletion of either one of the isoforms in single knockouts (cFNKO or pFNKO) only led to subtle changes in some of the analyzed parameters. Complete ablation of both cFN in the growth plate and circulating pFN in plasma resulted in significantly reduced postnatal body weight, body length, and bone length in the FNdKO mice. Assessment of the FNdKO adult bone microarchitecture using micro-CT revealed significantly reduced trabecular bone volume, trabecular network, bone mineral density, and increased bone marrow adiposity. Analysis of chondrogenesis in FNdKO mice showed changes in the proliferating and hypertrophic growth plate zones, consistent alterations in chondrogenic markers such as collagen type II and type X, reduced apoptosis of hypertrophic chondrocytes, and downregulation of bone formation markers. FNdKO mice also displayed decreased levels of transforming growth factor-β1 (TGFβ1) and downstream phospho-AKT levels, which are critical regulators of chondrogenesis and bone formation. In conclusion, the data demonstrate that FN is essential for proper chondrogenesis and postnatal bone development. Simultaneous deletion of both FN isoforms in the developing cartilage leads to critical TGFβ-mediated alterations in chondrogenic differentiation, resulting in bone and skeletal defects.