The metabolism of carbohydrate polymers drives microbial diversity in the human gut microbiota. It is unclear, however, whether bacterial consortia or single organisms are required to depolymerize highly complex glycans. Here we show that the gut bacterium Bacteroides thetaiotaomicron uses the most structurally complex glycan known: the plant pectic polysaccharide rhamnogalacturonan-II, cleaving all but 1 of its 21 distinct glycosidic linkages. The deconstruction of rhamnogalacturonan-II side chains and backbone are coordinated to overcome steric constraints, and the degradation involves previously undiscovered enzyme families and catalytic activities. The degradation system informs revision of the current structural model of rhamnogalacturonan-II and highlights how individual gut bacteria orchestrate manifold enzymes to metabolize the most challenging glycan in the human diet.

ABSTRACT Strep A is a human-exclusive bacterial pathogen killing annually more than 500,000 patients, and no current licensed vaccine exists. Strep A bacteria are highly diverse, but all produce an essential, abundant, and conserved surface carbohydrate, the Group A Carbohydrate, which contains a rhamnose polysaccharide (RhaPS) backbone. RhaPS is a validated universal vaccine candidate in a glycoconjugate prepared by chemical conjugation of the native carbohydrate to a carrier protein. We engineered the Group A Carbohydratte biosynthesis pathway to enable recombinant production using the industry standard route to couple RhaPS to selected carrier proteins within E. coli cells. The structural integrity of the produced recombinant glycoconjugate vaccines was confirmed by NMR spectroscopy and mass spectrometry. Purified RhaPS glycoconjugates elicited carbohydrate-specific antibodies in mice and rabbits and bound to the surface of multiple Strep A strains of diverse M-types, confirming the recombinantly produced RhaPS glycoconjugates as valuable vaccine candidates.

It is increasingly appreciated that members of the gut microbiota are key modulators of human health and the status of major diseases including cancer, diabetes and inflammatory bowel disease. Central to their survival is the ability to metabolise complex dietary and host-derived glycans including intestinal mucins. The latter are critical components of the gut epithelium glycocalyx and mucus barriers, essential for microbiota-gut homeostasis and protection from infections by pathogens. The prominent and model human gut microbe Bacteroides thetaiotaomicron (B. theta) is a versatile and highly efficient complex glycan degrader thanks to the expansion of gene clusters termed polysaccharide utilisation loci (PULs) in its genome. While the mechanisms for several singular dietary glycan-induced PULs have been elucidated, studies on the 16-18 mucin-induced PULs in B. theta significantly lag behind. A combination of the scale and complexity of B. theta transcriptomic response to mucins and complex glycan configurations of mucins represent major hurdles for the functional characterisation of the mucin induced PULs. As a result, there is very limited knowledge on how mucin metabolism is coordinated in B. theta and what specific PULs, genes and metabolites are critical for mucin-B. theta, and more generally mucin-microbiota interactions and their importance in microbiota-gut homeostasis. Here we show that a mucin inducible PUL BT4240-50, (i) encodes activities consistent with a machinery that couples the processing of mucin-O glycan glycoproteins with the metabolism of N-acetylgalactosamine (GalNAc), an abundant mucin O-glycan sugar; (ii) is important for competitive growth on mucins in-vitro; (iii) encodes a key kinase enzyme (BT4240) that is critical for GalNAc metabolism and (iv) has related PULs encoded by a range of prominent Bacteroides species in the human gut. Furthermore, BT4240 kinase was also critical for glycosaminoglycan metabolism, thus extending the PULs function beyond mucins. Our work advances our understanding of the vital metabolic processes that govern mucosal glycoprotein metabolism and by implication, a key aspect of host-microbiota interactions at mucosal surfaces and highlight GalNAc as a key metabolite targeted for competitive growth.

Abstract Microbial α- l- fucosidases catalyse the hydrolysis of terminal α- l -fucosidic linkages and can perform transglycosylation reactions. Based on sequence identity, α- l- fucosidases are classified in glycoside hydrolases (GHs) families of the carbohydrate-active enzyme database. Here we explored the sequence-function space of GH29 fucosidases. Based on sequence similarity network (SSN) analyses, 15 GH29 α- l- fucosidases were selected for functional characterisation. HPAEC-PAD and LC-FD-MS/MS analyses revealed substrate and linkage specificities for α1,2, α1,3, α1,4 and α1,6 linked fucosylated oligosaccharides and glycoconjugates, consistent with their SSN clustering. The structural basis for the substrate specificity of GH29 fucosidase from Bifidobacterium asteroides towards α1,6 linkages and FA2G2 N -glycan was determined by X-ray crystallography and STD NMR. The capacity of GH29 fucosidases to carry out transfucosylation reactions with GlcNAc and 3FN as acceptors was evaluated by TLC combined with ESI–MS and NMR. These experimental data supported the use of SSN to further explore the GH29 sequence-function space through machine-learning models. Our lightweight protein language models could accurately allocate test sequences in their respective SSN clusters and assign 34,258 non-redundant GH29 sequences into SSN clusters. It is expected that the combination of these computational approaches will be used in the future for the identification of novel GHs with desired specificities.

Abstract The plant hemicellulose xyloglucan (XyG) is secreted from the roots of numerous plant species, including cereals, and contributes towards soil aggregate formation in terrestrial systems. Whether XyG represents a key nutrient for plant-associated bacteria is unclear. The phylum Bacteroidota are abundant in the plant microbiome and provide several beneficial functions for their host. However, the metabolic and genomic traits underpinning their success remain poorly understood. Here, using proteomics, bacterial genetics, and genomics, we revealed that plant-associated Flavobacterium , a genus within the Bacteroidota, can efficiently utilise XyG through the occurrence of a distinct and conserved gene cluster, referred to as the Xyloglucan Utilisation Loci (XyGUL). Flavobacterium XyGUL is a hybrid of the molecular machinery found in gut Bacteroides spp., Cellvibrio japonicus , and the plant pathogen Xanthomonas . Combining protein biochemistry, computational modelling and phylogenetics, we identified a mutation in the enzyme required for initiating hydrolysis of the XyG polysaccharide, an outer membrane endoxyloglucanase glycoside hydrolase family 5 subfamily 4 (GH5_4), which enhances activity towards XyG. A subclade of GH5_4 homologs carrying this mutation were the dominant form found in soil and plant metagenomes due to their occurrence in Bacteroidota and Proteobacteria. However, only in members of the Bacteroidota spp., particularly Flavobacterium spp. was such a remarkable degree of XyGUL conservation detected. We propose this mechanism enables plant-associated Flavobacterium to specialise in competitive acquisition of XyG exudates and that this hemicellulose may represent an important nutrient source, enabling them to thrive in the plant microbiome, which is typified by intense competition for low molecular weight carbon exudates.