Summary Unlike many signaling proteins that function as binary switches between ‘on and off’ states, G protein-coupled receptors (GPCRs) exhibit basal activity that can be increased or decreased by numerous ligands. A given receptor can recognize multiple ligands, allosteric modulators, and transducers to create a complex free energy landscape. Many of the lowest energy states have been captured by static structural techniques while detailing the wells’ widths, metastable states, and the transition between them, is still in its infancy. Nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy can monitor the structure and dynamics of GPCR ensembles across fifteen orders-of-magnitude, but technical challenges have limited its application to super-microsecond timescales. Focusing on a prototypical peptide-binding GPCR, the neurotensin receptor 1 (NTS 1 ), we employed NMR and density functional theory (DFT) to probe global sub-nanosecond motions. The near random coil chemical shifts of the apo receptor produced a poor correlation with theoretical predictions that may indicate a high degree of conformational averaging in solution, a crystallization artifact, or both. Whereas orthosteric agonists and antagonists both rigidified the receptor, but to varying degrees, which suggests conformational entropy differentially contributes to their respective pharmacology. The strong correlations of observed and theoretical chemical shifts lend confidence to interpreting spectra in terms of local structure, methyl dihedral angle geometry, and pico-second timescale transitions. Together, our results suggest a role for sub-nanosecond dynamics and conformational entropy in GPCR ligand discrimination.

Abstract Accurate rotational correlation times ( τ c ) are critical for quantitative analysis of fast timescale NMR dynamics. As molecular weights increase, the classic derivation of τ c using transverse and longitudinal relaxation rates becomes increasingly unsuitable due to the non-trivial contribution of remote dipole-dipole interactions to longitudinal relaxation. Derivations using cross-correlated relaxation experiments, such as TRACT, overcome these limitations but are erroneously calculated in 65% of the citing literature. Herein, we developed an algebraic solutions to the Goldman relationship that facilitate rapid, point-by-point calculations for straightforward identification of appropriate spectral regions where global tumbling is likely to be dominant. The rigid-body approximation of the Goldman relationship has been previously shown to underestimate TRACT-based rotational correlation time estimates. This motivated us to develop a second algebraic solution that employs a simplified model-free spectral density function including an order parameter term that could, in principle, be set to an average backbone S 2 ≈ 0.9 to further improve the accuracy of τ c estimation. These solutions enabled us to explore the boundaries of the Goldman relationship as a function of the H-N internuclear distance ( r ), difference of the two principal components of the axially-symmetric 15 N CSA tensor ( Δδ N ), and angle of the CSA tensor relative to the N-H bond vector ( θ ). We hope our algebraic solutions and analytical strategies will increase the accuracy and application of the TRACT experiment.

The current standard method for amino acid signal identification in protein NMR spectra is sequential assignment using triple-resonance experiments. Good software and elaborate heuristics exist, but the process remains laboriously manual. Machine learning does help, but its training databases need millions of samples that cover all relevant physics and every kind of instrumental artifact. In this communication, we offer a solution to this problem. We propose polyadic decompositions to store millions of simulated three-dimensional NMR spectra, on-the-fly generation of artifacts during training, a probabilistic way to incorporate prior and posterior information, and integration with the industry standard CcpNmr software framework. The resulting neural nets take [ 1 H, 13 C] slices of mixed pyruvate–labeled HNCA spectra (different CA signal shapes for different residue types) and return an amino acid probability table. In combination with primary sequence information, backbones of common proteins (GB1, MBP, and INMT) are rapidly assigned from just the HNCA spectrum.

G-protein coupled receptors (GPCRs) are the largest class of membrane proteins in the human genome with high pharmaceutical relevance and implications to human health. These receptors share a prevalent architecture of seven transmembrane helices followed by an intracellular, amphipathic helix 8 (H8) and a disordered C-terminus. Technological advancements have led to over 1000 receptor structures in the last two decades, yet frequently H8 and the C-tail are conformationally heterogeneous or altogether absent. Here we synthesize a peptide comprising the neurotensin receptor 1 (NTS1) H8 and C-terminus (H8-Ctail) to investigate its structural stability, conformational dynamics and orientation in the presence of detergent and phospholipid micelles, which mimic the membrane. Circular dichroism (CD) and nuclear magnetic resonance (NMR) measurements confirm that zwitterionic 1,2-diheptanoyl-sn-glycero-3-phosphocholine is a potent stabilizer of H8 structure, whereas the commonly-used branched detergent lauryl maltose neopentyl glycol (LMNG) is unable to completely stabilize the helix – even at amounts four orders of magnitude greater than its critical micellar concentration. We then used NMR spectroscopy to assign the backbone chemical shifts. A series of temperature and lipid titrations were used to define the H8 boundaries as F376-R392 from chemical shift perturbations, changes in resonance intensity, and chemical-shift derived phi/psi angles. Finally, the H8 azimuthal and tilt angles, defining the helix orientation relative of the membrane normal were measured using paramagnetic relaxation enhancement (PRE) NMR. Taken together, our studies reveal the H8C-tail region is sensitive to membrane physicochemical properties and is capable of more adaptive behavior than previously suggested by static structural techniques.

ABSTRACT Interferon-stimulated gene-15 (ISG15) is an interferon-induced protein with two ubiquitin-like (Ubl) domains linked by a short peptide chain, and the conjugated protein of the ISGylation system. Similar to ubiquitin and other Ubls, ISG15 is ligated to its target proteins through a series of E1, E2, and E3 enzymes known as Uba7, Ube2L6/UbcH8, and HERC5, respectively. Ube2L6/UbcH8 plays a literal central role in ISGylation, underscoring it as an important drug target for boosting innate antiviral immunity. Depending on the type of conjugated protein and the ultimate target protein, E2 enzymes have been shown to function as monomers, dimers, or both. UbcH8 has been crystalized in both monomeric and dimeric forms, but the functional state is unclear. Here, we used a combined approach of small-angle X-ray scattering (SAXS) and nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy to characterize UbcH8’s oligomeric state in solution. SAXS revealed a dimeric UbcH8 structure that could be dissociated when fused N-terminally to glutathione S-transferase. NMR spectroscopy validated the presence of a concentration-dependent monomer-dimer equilibrium and suggested a backside dimerization interface. Chemical shift perturbation and peak intensity analysis further suggest dimer-induced conformational dynamics at E1 and E3 interfaces - providing hypotheses for the protein’s functional mechanisms. Our study highlights the power of combining NMR and SAXS techniques in providing structural information about proteins in solution.

ABSTRACT Using a discrete, intracellular 19 F-NMR probe on transmembrane helix 6 (TM6) of the Neurotensin receptor 1 (NTS1), we aim to understand how ligands and transducers modulate the receptor’s structural ensemble in solution. For apo NTS1, 19 F-NMR spectra reveal an ensemble of at least three conformational substates (one inactive and two active-like) in equilibrium that exchange on the ms-s timescale. Dynamic NMR experiments reveal that these substates follow a linear three-site exchange process that is both thermodynamically and kinetically remodeled by orthosteric ligands. As previously observed in other GPCRs, the full agonist is insufficient to completely stabilize the active-like state. The inactive substate is abolished upon coupling to β-arrestin-1 or the C-terminal helix of Gα q , which comprises ⍰60% of the GPCR/G protein interface surface area. Whereas β-arrestin-1 exclusively selects for pre-existing active-like substates, the Gα q peptide induces a new substate. Both transducer molecules promote substantial line-broadening of active-like states suggesting contributions from additional μs-ms exchange processes. Together, our study suggests i) the NTS1 allosteric activation mechanism may be alternatively dominated by induced fit or conformational selection depending on the coupled transducer, and ii) the available static structures do not represent the entire conformational ensemble observed in solution.

ABSTRACT The neurotensin receptor 1 (NTS 1 ) is a G protein-coupled receptor (GPCR) with promise as a drug target for the treatment of pain, schizophrenia, obesity, addiction, and various cancers. A detailed picture of the NTS 1 structural landscape has been established by X-ray crystallography and cryo-EM and yet, the molecular determinants for why a receptor couples to G protein versus arrestin transducers remain poorly defined. We used 13 C ε H 3 -methionine NMR spectroscopy to show that phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate (PIP2) promotes transducer complexation not by dramatically altering the receptor structure but by strengthening long-range allosteric connections, in the form of correlated conformational kinetics, between the orthosteric pocket and highly-conserved activation motifs. β-arrestin-1 further remodels the receptor ensemble by reducing conformational exchange kinetics for a subset of resonances, whereas G protein coupling has little to no effect on the rate. A β-arrestin biased allosteric modulator transforms the NTS 1 :G protein complex into a concatenation of substates, without triggering transducer dissociation, suggesting that it may function by stabilizing signaling incompetent G protein conformations such as the non-canonical state. Together, our work demonstrates the importance of kinetic information to a complete picture of the GPCR activation landscape.