Abstract Medulloblastoma (MB) is one of the most common malignant brain tumors in children. Current preclinical in vivo model systems for MB have increased our understanding of molecular mechanisms regulating MB development; however, they may not be suitable for high-throughput screening efforts. We demonstrate here that transplantation of seven different MB cell lines or patient-derived cells into the blastula stage of zebrafish embryos leads to orthotopic tumor cell growth that can be observed within 24 hours after transplantation. Importantly, the homing of transplanted cells to the hindbrain region and the aggressiveness of tumor growth are enhanced by pre-culturing cells in a neural stem cell-like medium. The change in culture conditions rewires the transcriptome towards a more migratory and neuronal progenitor phenotype, including the expression of guidance molecules SEMA3A and EFNB1, both of which correlate with lower overall survival in MB patients. Furthermore, we highlight that the orthotopic zebrafish MB xenograft model has the potential to be used for high-throughput drug screening. Key points Medulloblastoma cells home to the hindbrain region in developing zebrafish embryos. Neural stem cell culture conditions improve the homing capacity of MB tumor cells. Medulloblastoma-transplanted zebrafish embryos can be used as a high-throughput in vivo model for drug screening. Importance of the Study One of the challenges of accurately modeling medulloblastoma is the large heterogeneity in tumor characteristics. To accurately model this heterogeneous disease, patient-derived xenograft mouse models are currently the standard. However, such mouse models are labor intensive, time-consuming, and not suitable for high-throughput studies. Here, we describe a quick and straightforward zebrafish xenograft model that provides a promising alternative to these existing mouse models. We demonstrate that this model can be utilized to study tumor cell growth of several major medulloblastoma subgroups. More importantly, our model facilitates high-throughput drug testing, providing a scalable opportunity for in vivo drug screenings that will support the discovery of novel therapeutic compounds against medulloblastoma.

Abstract In the last decade, there has been a surge in developing immunotherapies to enhance the immune system's ability to eliminate tumor cells. Bispecific antibodies known as T cell engagers (TCEs) present an attractive strategy in this pursuit. TCEs aim to guide cytotoxic T cells toward tumor cells, thereby inducing a strong activation and subsequent tumor cell lysis. In this study, we investigated the activity of different TCEs on both conventional alpha‐beta (αβ) T cells and unconventional gamma delta (γδ) T cells. TCEs were built using camelid single‐domain antibodies (VHHs) targeting the tumor‐associated antigen CEACAM5 (CEA), together with T cell receptor chains or a CD3 domain. We show that Vγ9Vδ2 T cells display stronger in vitro antitumor activity than αβ T cells when stimulated with a CD3xCEA TCE. Furthermore, restricting the activation of fresh human peripheral T cells to Vγ9Vδ2 T cells limited the production of protumor factors and proinflammatory cytokines, commonly associated with toxicity in patients. Taken together, our findings provide further insights that γδ T cell‐specific TCEs hold promise as specific, effective, and potentially safe molecules to improve antitumor immunotherapies.

Abstract Over the past decade, an increasing number of immunotherapies aiming to improve the ability of the immune system to effectively eradicate tumor cells have been developed. Among them, targeting effector T cell subsets of the immune system with bispecific antibodies, called T Cell Engagers (TCEs), represents an attractive strategy. TCEs are designed to specifically direct cytotoxic T cells towards tumor cells, thereby inducing a strong activation leading to the lysis of tumor cells. New strategies for targeting specific T-cell subsets are currently being explored. In this study, we investigated the activity of different TCEs on both conventional alpha beta (αβ) T cells and unconventional gamma delta (γδ) T cells. We generated TCE molecules based on camelid single-domain antibodies (VHHs) that target the tumor-associated antigen CEACAM5 (CEA), together with particular T-cell receptor chains (TCRs) or a CD3 domain. The in vitro biological activity of the TCEs against the colon carcinoma cell line LS174T was measured using fresh and cultured human Vγ9Vδ2 and αβ T cells. We showed that Vγ9Vδ2 T cells display stronger antitumor activity in vitro than αβ T cells when activated with a CD3xCEA TCE. Furthermore, restricting T cell activation to Vγ9Vδ2 T cells limits the production of pro-tumor factors and pro-inflammatory cytokines, which are often associated with toxicity in patients. Taken together, these results suggest that Vγ9Vδ2γδ T cell-specific TCEs may represent safe, novel, specific, and effective molecules for improving antitumor immunotherapies.

Abstract Background Medulloblastoma (MB) is one of the most common malignant brain tumors in children. Current treatments have increased overall survival but can lead to devastating side effects and late complications in survivors, emphasizing the need for new, improved targeted therapies that specifically eliminate tumor cells while sparing the normally developing brain. Methods Here, we used a SHH-MB model based on a patient-derived neuroepithelial stem (NES) cell system for an unbiased high-throughput screen with a library of 172 compounds with known targets. Compounds were evaluated in both healthy neural stem cells and tumor cells derived from the same patient. Based on the difference of cell viability and drug sensitivity score between normal cells and tumor cells, hit compounds were selected and further validated in vitro and in vivo. Results We identified PF4708671 (S6K1 inhibitor) as a potential agent that selectively targets Sonic Hedgehog (SHH) driven MB tumor cells while sparing neural stem cells and differentiated neurons. Subsequent validation studies confirmed that PF4708671 inhibited the growth of SHH-MB tumor cells both in vitro and in vivo, and that knockdown of S6K1 resulted in reduced tumor formation. Conclusions Overall, our results suggest that inhibition of S6K1 specifically affects tumor growth, whereas it has less effect on non-tumor cells. Our data also show that the NES cell platform can be used to identify potentially effective new therapies and targets for SHH-MB.

Background Medulloblastoma (MB) is one of the most common malignant brain tumors in children. Current treatments have increased overall survival but can lead to devastating side effects and late complications in survivors, emphasizing the need for new, improved targeted therapies that specifically eliminate tumor cells while sparing the normally developing brain. Methods Here, we used a SHH-MB model based on a patient-derived neuroepithelial stem cell system for an unbiased high-throughput screen with a library of 172 compounds with known targets. Compounds were evaluated in both healthy neural stem cells and tumor cells derived from the same patient. Based on the difference of cell viability and drug sensitivity score between normal cells and tumor cells, hit compounds were selected and further validated in vitro and in vivo. Results We identified PF4708671 (S6K1 inhibitor) as a potential agent that selectively targets Sonic Hedgehog (SHH) driven MB tumor cells while sparing neural stem cells and differentiated neurons. Subsequent validation studies confirmed that PF4708671 inhibited the growth of SHH-MB tumor cells both in vitro and in vivo, and that knockdown of S6K1 resulted in reduced tumor formation. Conclusion Overall, our results suggest that inhibition of S6K1 specifically affects tumor growth, whereas it has less effect on non-tumor cells. Our data also show that the NES cell platform can be used to identify potentially effective new therapies and targets for SHH-MB.