Iron is an irreplaceable co-factor for metabolism. Iron deficiency affects >1 billion people, causing symptoms including anaemia and impaired immunity. Nevertheless, precisely how iron deprivation impacts immune cell function remains poorly characterised. We therefore interrogated how physiologically low iron availability affected activated CD8+ T cell metabolism and function, using multi-omic and metabolic labelling approaches. Iron limitation profoundly stalled proliferation without influencing cell viability, altered histone methylation status and disrupted mitochondrial membrane potential. Consistently, metabolism of glucose and glutamine in the TCA cycle was limited, indeed TCA cycle activity was partially reversed to a reductive trajectory. Previous studies have shown mitochondria-derived aspartate is crucial for proliferation of transformed cells. Surprisingly, we found aspartate was increased in stalled iron deficient CD8+ T-cells, but was not utilised cytosolically for nucleotide synthesis, likely due to trapping within depolarised mitochondria. Conversely, exogenous aspartate, which directly accesses the cytosol, markedly rescued the clonal expansion of even severely iron-deficient CD8+ T-cells. Overall, iron scarcity creates a mitochondrial-located metabolic bottleneck impairing T-cells, which can be bypassed by resupplying inhibited biochemical processes with aspartate. These findings reveal molecular consequences of iron deficiency for CD8+ T cell function, providing mechanistic insight into the basis for immune impairment during iron deficiency.

Abstract Germinal centre (GC) B cells proliferate at some of the highest rates of any mammalian cell, yet the metabolic processes which enable this are poorly understood. We performed integrated metabolomic and transcriptomic profiling of GC B cells, and found that metabolism of the non-essential amino acid asparagine (Asn) was highly upregulated. Asn was conditionally essential to B cells, and its synthetic enzyme, asparagine synthetase (ASNS) was upregulated following their activation, particularly more markedly in the absence of Asn, through the integrated stress response sensor general control non-derepressible 2 (GCN2). When Asns is deleted B cell survival and proliferation in low Asn conditions were strongly impaired, and removal of environmental Asn by asparaginase or dietary restriction markedly compromised the GC reaction, impairing affinity maturation and the humoral response to influenza infection. Using stable isotope tracing, we found that metabolic adaptation to the absence of Asn requires ASNS, and that oxidative phosphorylation, mitochondrial homeostasis, and synthesis of nucleotides was particularly sensitive to Asn deprivation. Altogether, we reveal that Asn metabolism acts as a key regulator of B cell function and GC homeostasis.

Abstract Germinal centre (GC) B cells undergo proliferation at very high rates in a hypoxic microenvironment, but the cellular processes driving this are incompletely understood. Here we show that the mitochondria of GC B cells are highly dynamic, with significantly upregulated transcription and translation rates associated with the activity of transcription factor mitochondrial A (TFAM). TFAM, whilst also necessary for normal B cell development, is required for entry of activated GC-precursor B cells into the germinal centre reaction, and deletion of Tfam significantly impairs GC formation, function, and output. Loss of TFAM in B cells compromises the actin cytoskeleton and impairs cellular motility of GC B cells in response to chemokine signalling, leading to their spatial disorganisation. We show that B cell lymphoma substantially increases mitochondrial translation, and deletion of Tfam in B cells is protective against the development of lymphoma in a c-Myc transgenic model. Finally, we show that pharmacologic inhibition of mitochondrial transcription and translation inhibits growth of GC-derived human lymphoma cells, and induces similar defects in the actin cytoskeleton.

Abstract Background Assessment of cellular immune responses by combining intracellular cytokine staining and immunophenotyping using flow cytometry enables the simultaneous measurement of T cell phenotype and effector function in response to pathogens and vaccines. The use of whole blood samples rather than peripheral blood mononuclear cells avoids both the need for immediate processing and loss of functional antigen presenting cells due to processing and cryopreservation. Using whole blood provides the possibility to stimulate peripheral T cells in situ , and is more suitable for studies where sample volume is limited, such as those involving children, the elderly and critically ill patients. The aim of this study was to provide a robust tool for the assessment of antigen-specific T cell responses in a field site setting with limited resources. Methodology/Principle Findings We optimised a flow cytometry-based whole blood intracellular cytokine assay (WBA) with respect to duration of antigen stimulation and intracellular protein retention time. We demonstrate the ability of the WBA to capture polyfunctional T cell responses in the context of acute scrub typhus infection, by measuring IFN-γ, TNF and IL-2 in CD4+ and CD8+ T cells in response to the causative agent O. tsutsugamushi (OT). Using an optimised OT antigen preparation, we demonstrate the presence of polyfunctional antigen-specific memory CD4+ T cells in the blood of scrub typhus patients. Conclusions/Significance In conclusion, this flow cytometry-based WBA is well-suited for use at field study sites, and enables the assessment of polyfunctional T cell responses to infectious agents and vaccines through delineation of antigen-specific cytokine secretion at the single cell level. Author summary Scrub typhus is an acute febrile illness caused by the bite of infected chigger mites transmitting O. tsutsugamushi, a gramnegative obligate intracellular bacteria in the family Rickettsiaceae . The disease progression and clinical manifestations are closely associated with host immune responses. T cell responses are in strong relation with immune protection against scrub typhus. As there is limited knowledge on specific T cell roles against scrub typhus, we optimized a flow-cytometer based protocol to assess O. tsutsugumushi -specific T cell responses in whole blood samples, which is suitable for studies in limited resource settings. This method requires low blood volumes, but enables multiparametric immunophenotyping assessments. The optimized WBA protocol could be a useful tool for comprehensive immunopathological studies in scrub typhus, and other infectious diseases as well as vaccine studies in areas with limited availability of specialized equipment, while reliably capturing the complexity of the immune response.