The multi-enzyme pyruvate dehydrogenase complex (PDC) links glycolysis to the citric acid cycle by converting pyruvate into acetyl-coenzyme A and is essential for cellular energy metabolism. Although individual components have been characterized, the structure of intact PDC remains unclear, hampering our understanding of its composition and multi-step catalytic reactions. Here, we report the in-situ architecture of intact PDC within mammalian mitochondria by cryo-electron tomography. The organization of peripheral E1 and E3 multimers varies substantially among PDCs. We discovered 1-46 E1 heterotetramers surrounding each PDC core, and up to 12 E3 dimers locating primarily along the pentagonal openings. Furthermore, we observed dynamic interactions of the substrate translocating lipoyl domains (LDs) with both E1 and E2, implicating the mechanism of substrate channeling. Our findings reveal the intrinsic dynamics of PDC peripheral compositions, suggesting an additional model in which the number of assembled E1 heterotetramer, E3 dimer, and functional LDs of PDC may be regulated to further control its catalytic activity.

Abstract The peptidoglycan (PG) layer is a mesh-like structure within the cell envelope essential for maintenance of cell shape and resistance to osmotic stress, and therefore is a primary target of many important and widely used antibiotics, such as β-lactams. In Gram-negative bacteria, while signal transduction systems that monitor the state of the inner- and outer-membranes have been extensively studied and well understood, much less is known about how cells sense and respond to PG-targeting stresses. Here we show that a novel bacterial two-component system (PghKR) from Shewanella oneidensis is capable of sensing and responding to PG damage. This system is specifically activated in cells exposed to various PG-targeting antibiotics or carrying a defect in PG synthesis, resulting in induced expression of blaA and relV , which encode a β-lactamase conferring resistance to β-lactams and a small ppGpp synthetase responsible for antibiotic tolerance, respectively. Intriguingly, the PghKR homologs are widespread among several classes of Proteobacteria and the periplasmic domain of sensor kinase PghK contains a family 9 carbohydrate-binding module that is required for signal perception, implying that the signals could be the glycan fragments of PG. Overall, our results provide critical insights into the regulation of PG homeostasis in Gram-negative bacteria.

Abstract Cytochrome c maturation (CCM), a posttranslational modification involving covalent attachment of heme to polypeptides (apocyt c ), is essential for the activity and cellular function of cytochromes c . Here, we identify and substantiate CcmB as heme translocase in bacteria. When in excess, CcmB expels intracellular heme into the periplasm and thus is detrimental to the cell. We then show that complexation with CcmACD ensures heme translocated by CcmB to be used for CCM only. Moreover, structural analysis and atomistic molecular dynamics simulations reveal that CcmB absorbs heme from the membrane to a heme pocket formed in the dimer interface of the transmembrane helix‐bundles. These data, collectively by providing detailed insights into the conformational landscape of CcmB during heme entry, fill in the missing link in our understanding of the heme translocation for CCM.