Abstract RT-PCR and Northern blots have long been used to study RNA isoforms usage for single genes. Recently, advancements in long read sequencing have yielded unprecedented information about the usage and abundance of these RNA isoforms. However, visualization of long-read sequencing data remains challenging due to the high information density. To alleviate these issues we have developed NanoBlot, a simple, open-source, command line tool, which generates Northern blot and RT-PCR-like images from third generation sequencing data. NanoBlot accepts processed bam files. Plotting is based around ggplot2 and is easily customizable. Advantages of NanoBlots include: designing probes to visualize isoforms which would be impossible with traditional RT-PCR or Northern blots, excluding reads from the Nanoblots based on the presence or absence of a specified region and, multiplexing plots with multiple colors. We present examples of NanoBlots compared to actual northern blot data. In addition to traditional gel-like images, NanoBlot also outputs other visualizations such as violin plots. The use of Nanoblot should provide a simple answer to the challenge of visualization of long-read RNA sequencing data.

Identification of splice sites is a critical step in pre-mRNA splicing since definition of the exon/intron boundaries controls what nucleotides are incorporated into mature mRNAs. The intron boundary with the upstream exon is initially identified through interactions with the U1 snRNP. This involves both base pairing between the U1 snRNA and the pre-mRNA as well as snRNP proteins interacting with the 5' splice site/snRNA duplex. In yeast, this duplex is buttressed by two conserved protein factors, Yhc1 and Luc7. Luc7 has three human paralogs (LUC7L, LUC7L2, and LUC7L3) which play roles in alternative splicing. What domains of these paralogs promote splicing at particular sites is not yet clear. Here, we humanized the zinc finger domains of the yeast Luc7 protein in order to understand their roles in splice site selection using reporter assays, transcriptome analysis, and genetic interactions. While we were unable to determine a function for the first zinc finger domain, humanization of the second zinc finger domain to mirror that found in LUC7L or LUC7L2 resulted in altered usage of nonconsensus 5' splice sites. In contrast, the corresponding zinc finger domain of LUC7L3 could not support yeast viability. Further, humanization of Luc7 can suppress mutation of the ATPase Prp28, which is involved in U1 release and exchange for U6 at the 5' splice site. Our work reveals a role for the second zinc finger of Luc7 in splice site selection and suggests that different zinc finger domains may have different ATPase requirements for release by Prp28.

Abstract Many small nucleolar RNAs (snoRNA)s are processed from introns of host genes, but the importance of splicing for proper biogenesis and the fate of the snoRNAs is not well understood. Here we show that inactivation of splicing factors or mutation of splicing signals leads to the accumulation of partially processed hybrid mRNA-snoRNA transcripts (hmsnoRNA). HmsnoRNAs are processed to the mature 3′-ends of the snoRNAs by the nuclear exosome and bound by snoRNP proteins. HmsnoRNAs are unaffected by translation-coupled RNA quality control pathways, but they are degraded by the major cytoplasmic exonuclease Xrn1p due to their mRNA-like 5′-extensions. These results show that completion of splicing is required to promote complete and accurate processing of intron-encoded snoRNAs and that splicing defects lead to degradation of hybrid mRNA-snoRNA species by cytoplasmic decay, underscoring the importance of splicing for the biogenesis of intron encoded snoRNAs. Significance Statement Small nucleolar RNAs mediate modifications of nucleosides within ribosomal RNAs, which are necessary for proper ribosomal function and translation. Many snoRNAs are encoded within introns of host genes and accurate biogenesis of these small RNAs is required to produce functional snoRNAs. The work presented here shows that when the splicing reactions are inactivated, snoRNAs undergo a distinct biogenesis pathway which leads to the production of aberrant hybrid RNAs that contain both mRNAs and small RNAs components of the host genes. While snoRNAs are primarily found in the nucleolus, these hybrid RNAs are degraded by the cytoplasmic mRNA degradation pathway. These results demonstrate the importance of splicing to promote accurate snoRNA processing and prevent the production of aberrant mRNA-snoRNA hybrids.