Stem-cell-derived organoids recapitulate in vivo physiology of their original tissues, representing valuable systems to model medical disorders such as infectious diseases. Cryptosporidium, a protozoan parasite, is a leading cause of diarrhoea and a major cause of child mortality worldwide. Drug development requires detailed knowledge of the pathophysiology of Cryptosporidium, but experimental approaches have been hindered by the lack of an optimal in vitro culture system. Here, we show that Cryptosporidium can infect epithelial organoids derived from human small intestine and lung. The parasite propagates within the organoids and completes its complex life cycle. Temporal analysis of the Cryptosporidium transcriptome during organoid infection reveals dynamic regulation of transcripts related to its life cycle. Our study presents organoids as a physiologically relevant in vitro model system to study Cryptosporidium infection.

Immune escape has been recognised as one of the hallmarks of cancer. Overcoming this immunomodulatory process by tumour cells has become a major therapeutic target. Here we utilize organoid technology to study immune-cancer interactions and assess immunomodulation by colorectal cancer (CRC). Transcriptional profiling and flow cytometry revealed that organoids maintain differential expression of immunomodulatory molecules present in primary tumours. Finally, we established a method to model antigen-specific epithelial cell killing and cancer immunomodulation in vitro using CRC organoids co-cultured with cytotoxic T cells. Our method may serve as a first step to rebuilding the tumor microenvironment in vitro.

Wnt/β-catenin signalling is a primary pathway for stem cell maintenance during tissue renewal and a frequent target for mutations in cancer. Impaired Wnt receptor endocytosis due to loss of the ubiquitin ligase RNF43 gives rise to Wnt-hypersensitive tumours that are susceptible to anti-Wnt-based therapy. Contrary to this paradigm, we identify a class of RNF43 truncating cancer mutations that strongly induce β-catenin-mediated transcription, despite exhibiting retained Wnt receptor downregulating activity. Mechanistically, these RNF43 mutants trap Casein Kinase (CK)1 at the plasma membrane, which prevents β-catenin turnover and propels ligand-independent Wnt target gene transcription. When introduced in human colon stem cells, these oncogenic RNF43 mutants cooperate with p53 loss to drive a niche-independent program for self-renewal and proliferation. Importantly, onco-RNF43 mutations, unlike conventional LOF RNF43 mutations, confer resistance to anti-Wnt-based therapy. Our data demonstrate the relevance of studying patient-derived mutations for understanding disease mechanisms and improved applications of precision medicine.

ABSTRACT Maintenance of homeostatic processes ensure curtailment of intestinal tumorigenesis. Inactivating mutations to Adenomatous Polyposis Coli ( Apc ) result in aberrantly activated Wnt signalling and initiates colorectal cancer (CRC) in approx. 80% of cases, yet our understanding of the subcellular mechanisms that modulate dysregulated pathway activity is limited. Here, using a conditional in vivo genetic screen, we identify Rab35 GTPase as a novel tumour suppressor that modulates regional Wnt activity after loss of Apc in progenitor cells. Single cell analysis revealed that progenitor cells respond to Apc depletion by increasing the expression of a GTPase activating protein, which we named blackbelt , and triggering Rab35 disassociation from the plasma membrane. Mechanistically, we demonstrate that Rab35 controls the localisation and activation of the Rho GTPase, Cdc42, which functions as a relay to regulate JNK signalling. This in turn tunes the Wnt pathway upstream of β-catenin to direct proliferation and differentiation of progenitor cells. Importantly, we show that maintaining active JNK signalling is important for the propagation of Apc mutant mouse colon organoids. Our findings highlight a novel GTPase cascade that sustains aberrant Wnt activity in specific segments of the intestine and provides impetus to therapeutically exploit this pathway to target CRC.

Abstract Locally advanced rectal cancer is usually treated by neoadjuvant chemoradiotherapy. However, tumor response rates to this treatment vary greatly. Thus, most patients do not reach a complete remission and have to undergo tumor resection. In the present study, we introduce a patient-derived rectal cancer organoid platform that reflects clinical radiosensitivity and use this to screen 1596 drug-radiation combinations. We identify inhibitors of RAS-MAPK signaling, especially MEK inhibitors, strongly synergizing with radiation response. Mechanistically, MEK inhibitors suppressed radiation-induced activation of RAS-MAPK signaling, and selectively downregulated the homologous recombination DNA repair pathway component RAD51, thereby achieving radio-enhancement. Through testing drug-drug-radiation combinations in organoids and cell lines, we identified synergism between PARP and MEK inhibitors to further enhance the effect of radiation. Our data support clinical testing of combined MEK and PARP inhibition with radiotherapy in locally advanced rectal cancers. Graphical Abstract

Abstract Protein kinases control most cellular processes and aberrant kinase activity is involved in numerous diseases. To investigate the link between specific kinase activities and cellular phenotypes in heterogeneous cell populations and in vivo , we introduce molecular recorders of kinase activities for later analysis. Based on split-HaloTag and a phosphorylation-dependent molecular switch, our recorders become rapidly labeled in the presence of a specific kinase activity and a fluorescent HaloTag substrate. The kinase activity in a given cell controls the degree of fluorescent labeling whereas the recording window is set by the presence of the fluorescent substrate. We have designed specific recorders for four protein kinases, including protein kinase A. We apply our protein kinase A recorder for the sorting of heterogeneous cell populations and subsequent transcriptome analysis, in genome-wide CRISPR screens to discover regulators of PKA activity and for the tracking of neuromodulation in freely moving mice.