Abstract Bacterial cells are known to produce inhibitors of cell division in response to stress responses and developmental programs. Knowledge of the underlying molecular mechanisms remains however largely limited. In this study, we investigated the mechanism of transient cell division inhibition observed during the development of competence for transformation in the human pathogen Streptococcus pneumoniae . In this species, ComM, a membrane protein specifically produced during competence, transiently inhibits cell division to preserve genomic integrity during transformation. We show that ComM reduces specifically the dynamics of the septal peptidoglycan synthetic complex FtsW:PBP2x. We also present evidence that ComM interacts with the peptidoglycan precursor synthetic enzyme MurA, and show that overproduction of MurA suppresses FtsW:PBP2x deceleration along the cell division delay in competent cells. Collectively, our data support a model in which ComM interferes with MurA activity to reduce septal peptidoglycan synthesis during competence in S. pneumoniae .

Summary Bacterial competence for genetic transformation is a well-known species-specific differentiation program driving genome plasticity, antibiotic resistance and virulence in many pathogens. How competence regulation is spatiotemporally integrated in the cell is ill-defined. Here, we unraveled the localization dynamics of the key regulators that master the two intertwined transcription waves controlling competence in Streptococcus pneumoniae . The first wave relies on a stress-inducible phosphorelay system, made up of the ComD and ComE proteins, and the second is directed by an alternative sigma factor, σ X , which includes in its regulon the DprA protein that turns off competence through interaction with phosphorylated ComE. Remarkably, we found that ComD, σ X and DprA stably co-localize at a single cell pole over the competence period. In contrast, ComE assembles into dynamic patches in the cell periphery, colocalizing temporarily with DprA and ComD at the pole. Furthermore, we provide evidence that σ X directly conveys DprA polar anchoring. Through this protein targeting function, σ X is shown to be actively involved in the timely shut-off of the competence cycle, hence preserving cell fitness. Altogether, this study unveils an unprecedented role for a bacterial transcription σ factor in spatially coordinating the negative feedback loop of its own genetic circuit.

Abstract Competence for natural transformation is a central driver of genetic diversity in bacteria. In the human pathogen Streptococcus pneumoniae , competence exhibits a populational character mediated by the stress-induced ComABCDE quorum-sensing (QS) system. Here, we explore how this cell-to-cell communication mechanism proceeds and the functional properties acquired by competent cells grown under lethal stress. We show that populational competence development depends on self-induced cells stochastically emerging in response to stresses, including antibiotics. Competence then propagates through the population from a low threshold density of self-induced cells, defining a biphasic Self-Induction and Propagation (SI&P) QS mechanism. We also reveal that a competent population displays either increased sensitivity or improved tolerance to lethal doses of antibiotics, dependent in the latter case on the competence-induced ComM division inhibitor. Remarkably, these surviving competent cells also display an altered transformation potential. Thus, the unveiled SI&P QS mechanism shapes pneumococcal competence as a health sensor of the clonal population, promoting a bet-hedging strategy that both responds to and drives cells towards heterogeneity.

Abstract RecA-mediated Homologous Recombination (HR) is a key mechanism for genome maintenance and plasticity in bacteria. It proceeds through RecA assembly into a dynamic filament on ssDNA, the presynaptic filament, which mediates DNA homology search and ordered DNA strand exchange. Here, we combined structural, single molecule and biochemical approaches to characterize the ATP-dependent assembly mechanism of the presynaptic filament of RecA from Streptococcus pneumoniae ( Sp RecA), in comparison to the Escherichia coli RecA ( Ec RecA) paradigm. Ec RecA polymerization on ssDNA is assisted by the Single-Stranded DNA Binding (SSB) protein, which unwinds ssDNA secondary structures that block Ec RecA nucleofilament growth. We report that neither of the two paralogous pneumococcal SSBs could assist Sp RecA polymerization on ssDNA. Instead, we found that the conserved RadA helicase promotes this Sp RecA nucleofilamentation in an ATP-dependent manner. This allowed us to solve the atomic structure of such a long native Sp RecA nucleopolymer by cryoEM stabilized with ATPγS. It was found to be equivalent to the crystal structure of the Ec RecA filament with a marked difference in how RecA mediates nucleotide orientation in the stretched ssDNA. Then, our results show that Sp RecA and Ec RecA HR activities are different, in correlation with their distinct ATP-dependent ssDNA binding modes.

Natural genetic transformation is a widespread mechanism of bacterial horizontal gene transfer. Transformation involves the internalization of exogenous DNA as single strands, followed by chromosomal integration via homologous recombination, promoting acquisition of new genetic traits. Transformation occurs during a distinct physiological state called competence, during which all proteins required to transform are produced. In the human pathogen Streptococcus pneumoniae, competence is controlled by a two-component system ComDE, which is induced by an exported peptide pheromone. DprA is universal among transformable species, strongly and specifically induced during pneumococcal competence, and crucial for pneumococcal transformation. Pneumococcal DprA plays three crucial roles in transformation and competence. Firstly, DprA protects internalized single-stranded (ss) DNA from degradation. Secondly, DprA loads the homologous recombinase RecA onto transforming ssDNA to promote transformation. Finally, DprA interacts with the response regulator ComE to shut-off pneumococcal competence. Pneumococcal shut-off has been linked to physiology, with long growth delays in competent dprA- cells. Here, we explored the effect of altering the cellular levels of DprA on these three roles. High cellular levels of DprA were not required for the primary role of DprA as a transformation-dedicated recombinase loader or for protection of transforming ssDNA. In contrast, full expression of dprA was required for optimal competence shut-off. Full expression of dprA was also crucial for transformant fitness. High cellular levels of DprA in competent cells thus ensure the fitness of pneumococcal transformants by promoting competence shut-off. This promotes survival and propagation of transformants, thus maximizing the adaptive potential of this human pathogen.

Abstract Natural transformation is a widespread molecular pathway of horizontal gene transfer involving the uptake and recombination of exogenous DNA. Exogenous DNA follows a pathway involving genes sequentially required for its capture, internalization, protection, and recombination with the chromosome. Most of these genes were identified through the isolation of transformation-defective mutants and/or based on their expression preceding natural transformation. Yet, genes required for key steps of the pathway remain elusive. We sought to identify any missing component by comparing Tn-seq data obtained in two distantly-related transformable diderm species, the human pathogen Legionella pneumophila and the cyanobacterium Synechococcus elongatus . We identified yraN , a widespread and highly conserved gene of unknown function required for natural transformation. We provide evidence that YraN is a nuclease associated with the ComM helicase, which cooperate to process the D-loop formed by the invasion of the transforming DNA in the chromosomal DNA strands. We propose a model in which cleavage of the displaced strand by YraN can promote the recombination of transforming DNA, leading to extended recombination events. The identification of this YraN/ComM nuclease/helicase system supports the hypothesis that bacteria possess a conserved pathway for the transport and recombination of exogenous DNA. Significance Many bacteria use a dedicated pathway to internalize and integrate extracellular DNA into their chromosome. This allows them to naturally acquire genes, or gene variants, that can confer them new traits, hence the term of natural transformation. Although reported nearly a century ago by Frederick Griffith, several aspects of the mechanism of natural transformation remain elusive. Specifically, it is not clear whether or not all the conserved molecular players of the pathway have been identified. We queried two distinct bacterial species for any gene that would be required for natural transformation. We confirmed all core players of the pathway, but also uncovered a highly conserved one, YraN. We provide evidence that YraN is an endonuclease, which in association with the ComM helicase, promotes the efficient integration of the extracellular DNA in the bacterial chromosome.

Abstract Some DNA helicases play key roles in genome maintenance and plasticity through their branch migration activity in distinct pathways of homologous recombination. RadA is a highly conserved bacterial helicase involved in both DNA repair in all species and in natural transformation in Gram positive firmicutes. In others, ComM is the natural transformation-specific helicase. Both RadA and ComM form hexameric rings and use ATP hydrolysis as a source of energy. In this work we present the cryoEM structures of RadA and ComM interacting with DNA and ATP analogues. This is the first structure reported for ComM, and the first structure of RadA in its active state. In particular, this study unveiled a molecular switch for ATP hydrolysis and DNA binding coupling in RadA and the role of the Lon protease-like domain, shared by RadA and ComM. Together our results provide new insights on the branch migration mechanism at the molecular level in the context of homologous recombination.

Homologous recombination (HR) is a universally conserved mechanism of DNA strand exchange between homologous sequences, driven in bacteria by the universal recombinase RecA. HR is key for the maintenance of bacterial genomes via replication fork restart and DNA repair, as well as for their plasticity via the widespread mechanism of natural transformation. Transformation involves the capture and internalisation of exogenous DNA in the form of single strands (ssDNA), followed by chromosomal integration via HR. In the human pathogen Streptococcus pneumoniae, transformation occurs during a transient, stress-induced physiological state called competence. RecA and its partner DNA branch migration translocase RadA both cooperate in HR during transformation and in some recombinational DNA repair pathways of genome maintenance. Both recA and radA genes are basally expressed and transcriptionally induced during competence. In this study, we explored the importance of competence induction of recA and radA expression in transformation and genome maintenance processes. We confirmed that competence induction of recA was important for optimal transformation, but found this was not the case for radA. In contrast, the competence induction of both genes was required for optimal tolerance faced with transient exposure to the lethal genotoxic agent methyl methanesulfonate (MMS). However, this was not the case for another DNA-damaging agent, norfloxacin. These results show that competence induction of HR effectors is important for the increased tolerance to genotoxic stress provided to competent pneumococcal cells. This reinforces the finding that pneumococcal competence is a stress-sensing mechanism, transiently increasing the expression of some genes not to optimise transformation but to improve survival faced with specific lethal stresses.

Abstract Homologous recombination (HR) is a crucial mechanism of DNA strand exchange that promotes genetic repair and diversity in all kingdoms of life. Bacterial HR is driven by the universal recombinase RecA, assisted by dedicated mediators that promote its polymerization on single-stranded DNA (ssDNA). In bacteria, natural transformation is a prominent HR-driven mechanism of horizontal gene transfer specifically dependent on the conserved DprA recombination mediator. Transformation involves internalisation of exogenous DNA as ssDNA, followed by its integration into the chromosome by RecA-directed HR. How DprA-mediated RecA filamentation on transforming ssDNA is spatiotemporally coordinated with other cellular processes remains unknown. Here, we tracked the localisation of functional fluorescent fusions to DprA and RecA in Streptococcus pneumoniae and revealed that both accumulate in an interdependent manner with internalised ssDNA at replication forks. In addition, dynamic RecA filaments were observed emanating from replication forks, even with heterologous transforming DNA, which probably represent chromosomal homology search. In conclusion, this unveiled interaction between HR transformation and replication machineries highlights an unprecedented role for replisomes in anchoring transforming ssDNA to the chromosome, which would define a pivotal early HR step for its chromosomal integration.

The rapid spread of antimicrobial resistance and vaccine escape in the opportunistic human pathogen Streptococcus pneumoniae can be largely attributed to competence-induced transformation. To better understand why competence-induced transformation is so effective, we studied the dynamics of this process at the single-cell level. We show that within isogenic populations, all cells become naturally competent and bind exogenous DNA. In addition, we find that transformation is highly efficient and that the chromosomal location of the integration site or whether the transformed gene is encoded on the leading or lagging strand has limited influence on recombination efficiency. Indeed, we have observed multiple recombination events in single recipients in real-time. However, because of saturation of the DNA uptake and integration machinery and because a single stranded donor DNA replaces the original allele, we find that transformation efficiency has an upper threshold of approximately 50% of the population. Counterintuitively, in the presence of multiple transforming DNAs, the fraction of untransformed cells increases to more than 50%. This results in a fail-safe strategy for the population as half of the population generally keeps an intact copy of the original genome. Together, this work advances our understanding of pneumococcal genome plasticity.