Abstract Amino acid bioavailability impacts mRNA translation in a codon depending manner. Here, we report that the anti-cancer MAPK inhibitors (MAPKi) decrease the intracellular concentration of aspartate and glutamate in melanoma cells. This results in the accumulation of ribosomes on codons corresponding to these amino acids and triggers the translation-dependent degradation of mRNAs encoding aspartate- and glutamate-rich proteins mostly involved in DNA metabolism. Consequently, cells that survive to MAPKi degrade aspartate and glutamate to generate energy, which simultaneously decreases their needs in amino acids owing to the downregulation of aspartate- and glutamate-rich proteins involved in cell proliferation. Concomitantly, the downregulation of aspartate- and glutamate-rich proteins involved in DNA repair increases DNA damage loads. Thus, DNA repair defects, and therefore mutations, are, at least in part, a secondary effect of the metabolic adaptation of cells exposed to MAPKi.

ABSTRACT One challenge faced by scientists from the alternative RNA splicing field is to decode the cooperative or antagonistic effects of splicing factors to understand and eventually predict splicing outcomes on a genome-wide scale. In this manuscript, we introduce SplicingLore, an open access database and web resource that help to fill this gap in a straightforward manner. The database contains a collection of RNA-seq-derived lists of alternative exons regulated by a total of 75 different splicing factors. All datasets were processed in a standardized manner, ensuring valid comparisons and correlation analyses. The user can easily retrieve a factor-specific set of differentially included exons from the database, or provide a list of exons and search which splicing factor(s) control(s) their inclusion. Our simple workflow is fast and easy to run, and it ensures a reliable calculation of correlation scores between the tested datasets. As a proof of concept, we predicted and experimentally validated a novel functional cooperation between the RNA helicases DDX17 and DDX5 and the HNRNPC protein. SplicingLore is available at https://splicinglore.ens-lyon.fr/ .

Summary The p65/RelA factor of NF-κB plays a pivotal role in coordinating gene expression in response to diverse stimuli, including viral infections. At the chromatin level, p65/RelA regulates gene transcription and alternative splicing (AS) through promoter enrichment and genomic exon occupancy, respectively. However, the mechanisms underlying the coordination of these processes across distinct genes remain elusive. In this study, we employed the HTLV-1 Tax oncoprotein, a potent activator of NF-κB, to investigate the integrative relationship between 3D chromatin architecture, NF-κB-regulated transcription and AS. Our analysis revealed that Tax induces a pronounced reorganization of the 3D genome, resulting in the formation of multigene complexes that comprise genes regulated either transcriptionally or through AS. Notably, we found that the Tax-induced gene-gene contact between the two master genes NFKBIA and RELA is associated with their differential regulation in gene expression and AS, respectively. Through dCas9-mediated approaches, we demonstrated that NFKBIA - RELA interaction is required for AS regulation and is caused by an intragenic enrichment of p65/RelA on RELA . Our findings shed light on new regulatory mechanisms upon HTLV-1 Tax and underscore the integral role of p65/RelA in coordinated regulation of NF-κB-responsive genes at both transcriptional and AS levels in the context of the 3D genome.

The inclusion of exons during the splicing process depends on the binding of splicing factors to short low-complexity regulatory sequences. The relationship between exonic splicing regulatory sequences and coding sequences is still poorly understood. We demonstrate that exons that are coregulated by any splicing factor share a similar nucleotide composition bias. We next demonstrate that coregulated exons preferentially code for amino acids with similar physicochemical properties because of the non-randomness properties of the genetic code. Indeed, amino acids sharing physicochemical properties correspond to codons that have the same nucleotide composition bias. These observations reveal an unanticipated bidirectional interplay between the physicochemical features encoded by exons and exon splicing regulation by splicing factors. We propose that the splicing regulation of an exon by a splicing factor is tightly interconnected with the physicochemical properties of the exon-encoded protein domain depending on the splicing-factor affinity for specific nucleotides.

ABSTRACT Transcript isoforms generated by intronic polyadenylation (IPA) are widely regulated in various biological processes and often encode protein isoforms. Microproteins are small proteins translated from small open reading frames (sORFs) in noncoding RNAs and mRNAs, but their production by IPA isoforms is unknown. Using 3’-seq and long-read RNA-seq analyses in lung cancer cells, we show that cisplatin, a DNA-crosslinking anticancer agent, upregulates IPA isoforms relative to full-length mRNAs in long genes. A subset of cisplatin-regulated IPA isoforms are poorly associated with heavy polysomes and terminate upstream of the annotated translation initiation codon of genes. Such IPA isoforms in the PHF20 and PRKAR1B genes are associated with light polysomes, contain Ribo-Seq-supported sORFs in an alternative last exon within the annotated 5’UTR part of genes, and are translated into microproteins. For PRKAR1B , the microprotein was detected by Western blot and immunofluorescence after transfection of a tagged isoform; and siRNA depletion of the endogenous IPA isoform, CRISPR deletion of the IPA site, or CRISPR mutation of the sORF initiation codon led to increased cell survival to cisplatin. Based on Ribo-Seq and mass-spectrometry data sets, we identified 156 genes producing both a canonical protein-coding mRNA and a microprotein-coding 5’UTR-located IPA isoform (coined miP-5’UTR-IPA isoform) regulated by cisplatin. Finally, the regulation of (miP-5’UTR-)IPA versus full-length isoforms by cisplatin involved an inhibition of transcription processivity in a FANCD2 and senataxin-dependent manner. Altogether, these findings reveal the novel paradigm of miP-5’UTR-IPA genes and their role in cancer cell response to a genotoxic agent. HIGHLIGHTS - Cisplatin increases intronic-polyadenylation versus full-length transcript isoforms in long genes through a FANCD2 and senataxin-dependent decrease of transcription processivity - A subset of cisplatin-regulated intronic-polyadenylation isoforms terminate in the annotated 5’UTR part of genes and encode microproteins, thus we coined them miP-5’UTR-IPA isoforms - The miP-5’UTR-IPA isoform of PRKAR1B impacts cisplatin sensitivity and its effect is mediated by its small ORF - We identify 156 genes producing both a canonical protein-coding mRNA and a microprotein-coding miP-5’UTR-IPA transcript

To characterize the rules governing exon recognition during splicing, we analysed dozens of RNA-seq datasets and identified about 3,200 GC-rich exons and about 4,000 AT-rich exons whose inclusion depends on different sets of splicing factors. We show that GC-rich exons have predicted RNA secondary structures at 5'ss, and are dependent on U1 snRNP-associated proteins. In contrast, AT-rich exons have a large number of branchpoints and SF1- or U2AF2-binding sites and are dependent on U2 snRNP-associated proteins. Nucleotide composition bias also influences local chromatin organization, with consequences for exon recognition during splicing. As the GC content of exons correlates with that of their hosting genes, isochores and topologically-associated domains, we propose that regional nucleotide composition bias leaves a local footprint at the exon level and induces constraints during splicing that can be alleviated by local chromatin organization and recruitment of specific splicing factors. Therefore, nucleotide composition bias establishes a direct link between genome organization and local regulatory processes, like alternative splicing.

The chronic NF-κB activation in inflammation and cancer has long been linked to persistent activation of NF-κB responsive gene promoters. However, NF-κB factors such as RELA also massively bind to gene bodies. Here, we demonstrate that the recruitment of RELA to intragenic regions regulates alternative splicing upon activation of NF-κB by the viral oncogene TAX of HTLV-1. Integrative analysis of RNA splicing and chromatin occupancy, combined with chromatin tethering assays, demonstrate that DNA-bound RELA interacts with and recruits the splicing regulator DDX17 in a NF-kB activation-dependent manner, leading to alternative splicing of target exons thanks to DDX17 RNA helicase activity. This NF-kB/DDX17 axis accounts for a major part of the TAX-induced alternative splicing landscape that mainly affects genes involved in oncogenic pathways. Collectively, our results demonstrate a physical and direct involvement of NF-κB in alternative splicing regulation, which significantly revisits our knowledge of HTLV-1 pathogenesis and other NF-κB-related diseases.

Abstract DEAD box helicases DDX17 and DDX5 control the termination of transcription and the associated cleavage of the 3’ end of transcripts. Here we show that the transcriptional readthrough induced by their depletion in neuroblastoma cells also results in increased production of chimeric transcripts from tandemly oriented genes. Analysis of neuroblastoma tumours in which chimeric transcripts are abundant revealed that low expression of the DDX17 and DDX5 genes is associated with poor overall patient survival. Low DDX17 expression is also significantly associated with high-risk tumours and is inversely correlated with MYCN oncogene amplification, suggesting a link between these two factors. We demonstrate that changes in MYCN expression do not affect the expression of either helicase, but alter transcription termination leading to the production of chimeric transcripts. We provide evidence that MYCN acts on termination through its direct binding to the 3’ region of genes and that it interacts with DDX17, suggesting that it may inhibit the activity of the helicase. Collectively, our work reveals a novel function of MYCN in transcription termination and suggests that the deregulation of MYCN and DDX17/DDX5 expression in neuroblastoma may lead to the expression of non-canonical and potentially harmful RNA molecules.