Embryonic stem cell (ESC) culture conditions are important for maintaining long-term self-renewal, and they influence cellular pluripotency state. Here, we report single cell RNA-sequencing of mESCs cultured in three different conditions: serum, 2i, and the alternative ground state a2i. We find that the cellular transcriptomes of cells grown in these conditions are distinct, with 2i being the most similar to blastocyst cells and including a subpopulation resembling the two-cell embryo state. Overall levels of intercellular gene expression heterogeneity are comparable across the three conditions. However, this masks variable expression of pluripotency genes in serum cells and homogeneous expression in 2i and a2i cells. Additionally, genes related to the cell cycle are more variably expressed in the 2i and a2i conditions. Mining of our dataset for correlations in gene expression allowed us to identify additional components of the pluripotency network, including Ptma and Zfp640, illustrating its value as a resource for future discovery.

N6-methyladenosine (m6A) is the most abundant mRNA modification in eukaryotes, playing crucial roles in multiple biological processes. m6A is catalyzed by the activity of methyltransferase-like 3 (Mettl3), which depends on additional proteins whose precise functions remain poorly understood. Here we identified Zc3h13 (zinc finger CCCH domain-containing protein 13)/Flacc [Fl(2)d-associated complex component] as a novel interactor of m6A methyltransferase complex components in Drosophila and mice. Like other components of this complex, Flacc controls m6A levels and is involved in sex determination in Drosophila We demonstrate that Flacc promotes m6A deposition by bridging Fl(2)d to the mRNA-binding factor Nito. Altogether, our work advances the molecular understanding of conservation and regulation of the m6A machinery.

In the fission yeast Schizosaccharomyces pombe, the RNA-Induced Transcriptional Silencing (RITS) complex has been proposed to target the chromosome via siRNA-dependent base-pairing interactions to initiate heterochromatin formation. Here we show that tethering of the RITS subunit, Tas3, to the RNA transcript of the normally active ura4+ gene silences ura4+ expression. This silencing depends on a functional RNAi pathway, requires the heterochromatin proteins, Swi6/HP1, Clr4/Suv39h, and Sir2, and is accompanied by the generation of ura4+ siRNAs, histone H3-lysine 9 methylation, and Swi6 binding. Furthermore, the ability of the newly generated ura4+ siRNAs to silence a second ura4+ allele in trans is strongly inhibited by the conserved siRNA nuclease, Eri1. Surprisingly, silencing of tethered ura4+, or ura4+ inserted within centromeric heterochromatin, or some of the endogenous centromeric repeat promoters, is not associated with changes in RNA polymerase II occupancy. These findings support a model in which targeting of nascent transcripts by RITS mediates chromatin modifications and suggest that cotranscriptional processing events play a primary role in the silencing mechanism.

ABSTRACT Microbes have evolved intricate communication systems that enable individual cells of a population to send and receive signals in response to changes in their immediate environment. In the fission yeast Schizosaccharomyces pombe , the oxylipin Nitrogen Signaling Factor (NSF) is part of such communication system, which functions to regulate the usage of different nitrogen sources. Yet, the pathways and mechanisms by which NSF acts are poorly understood. Here, we show that NSF physically interacts with the mitochondrial sulfide:quinone oxidoreductase Hmt2 and that it prompts a change from a fermentation- to a respiration-like gene expression program independently of the carbon source. Our results suggest that NSF activity is not restricted to nitrogen metabolism alone and that it could function as a rheostat to prepare a population of S. pombe cells for an imminent shortage of their preferred nutrients.

SUMMARY Transcription factors (TFs) are key regulators of gene expression, yet many of their targets and modes of action remain unknown. In Schizosaccharomyces pombe , one-third of TFs are solely homology-predicted, with few experimentally validated. We created a comprehensive library of 89 endogenously tagged S. pombe TFs, mapping their protein and chromatin interactions using immunoprecipitation-mass spectrometry and chromatin immunoprecipitation sequencing. Our study identified protein interactors for half the TFs, with over a quarter potentially forming stable complexes. We discovered DNA binding sites for most TFs across 2,027 unique genomic regions, revealing motifs for 38 TFs and uncovering a complex regulatory network of extensive TF cross- and autoregulation. Characterization of the largest TF family revealed conserved DNA sequence preferences but diverse binding patterns, and identified a repressive heterodimer, Ntu1/Ntu2, linked to perinuclear gene localization. Our TFexplorer webtool makes all data interactively accessible, offering new insights into TF interactions and regulatory mechanisms with broad biological relevance. HIGHLIGHTS Comprehensive strain library of endogenously tagged S. pombe TFs Experimentally determined atlas of TF interactions with proteins and chromatin TFexplorer web application for interactive exploration of TF interactomes Identification of repressive Nattou complex linked to perinuclear gene localization

ABSTRACT Removal of introns during pre-mRNA splicing, which is central to gene expression, initiates by base pairing of U1 snRNA with a 5’ splice site (5’SS). In mammals, many introns contain weak 5’SSs that are not efficiently recognized by the canonical U1 snRNP, suggesting alternative mechanisms exist. Here, we develop a cross-linking immunoprecipitation coupled to a high-throughput sequencing method, BCLIP-seq, to identify NRDE2 (Nuclear RNAi defective-2) and CCDC174 (Coiled-Coil Domain-Containing 174) as novel RNA-binding proteins in mouse ES cells that associate with U1 snRNA and unspliced 5’SSs. Both proteins bind directly to U1 snRNA independently of canonical U1 snRNP specific proteins, and they are required for the selection and effective processing of weak 5’SSs. Our results reveal that mammalian cells use non-canonical splicing factors bound directly to U1 snRNA to effectively select suboptimal 5’SS sequences in hundreds of genes, promoting proper splice site choice and accurate pre-mRNA splicing.

ABSTRACT Retrotransposon control in mammals is an intricate process that is effectuated by a broad network of chromatin regulatory pathways. We previously discovered ChAHP, a protein complex with repressive activity against SINE retrotransposons, composed of the transcription factor ADNP, chromatin remodeler CHD4, and HP1 proteins. Here we identify ChAHP2, a protein complex homologous to ChAHP, wherein ADNP is replaced by ADNP2. ChAHP2 is predominantly targeted to ERVs and LINEs, via HP1β-mediated binding of H3K9 trimethylated histones. We further demonstrate that ChAHP also binds these elements in a mechanistically equivalent manner to ChAHP2, and distinct from DNA sequence-specific recruitment at SINEs. Genetic ablation of ADNP2 alleviates ERV and LINE1 repression, which is synthetically exacerbated by additional depletion of ADNP. Together, our results reveal that the ChAHP and ChAHP2 complexes function to control both non-autonomous and autonomous retrotransposons by complementary activities, further adding to the complexity of mammalian transposon control.

Adenine auxotrophy is a commonly used non-selective genetic marker in yeast research. It allows investigators to easily visualize and quantify various genetic and epigenetic events by simply reading out colony color. However, manual counting of large numbers of colonies is extremely time-consuming, difficult to reproduce and possibly inaccurate. Using cutting-edge neural networks, we have developed a fully automated pipeline for colony segmentation and classification, which speeds up white/red colony quantification 100-fold over manual counting by an experienced researcher. Our approach uses readily available training data and can be smoothly integrated into existing protocols, vastly speeding up screening assays and increasing the statistical power of experiments that employ adenine auxotrophy.

Retrotransposon control in mammals is an intricate process that is effectuated by a broad network of chromatin regulatory pathways. We previously discovered ChAHP, a protein complex with repressive activity against short interspersed element (SINE) retrotransposons that is composed of the transcription factor ADNP, chromatin remodeler CHD4, and HP1 proteins. Here we identify ChAHP2, a protein complex homologous to ChAHP, in which ADNP is replaced by ADNP2. ChAHP2 is predominantly targeted to endogenous retroviruses (ERVs) and long interspersed elements (LINEs) via HP1β-mediated binding of H3K9 trimethylated histones. We further demonstrate that ChAHP also binds these elements in a manner mechanistically equivalent to that of ChAHP2 and distinct from DNA sequence-specific recruitment at SINEs. Genetic ablation of ADNP2 alleviates ERV and LINE1 repression, which is synthetically exacerbated by additional depletion of ADNP. Together, our results reveal that the ChAHP and ChAHP2 complexes function to control both nonautonomous and autonomous retrotransposons by complementary activities, further adding to the complexity of mammalian transposon control.