During fasting and after exercise, skeletal muscle efficiently switches from carbohydrate to lipid as the main energy source to preserve glycogen stores and blood glucose levels for glucose-dependent tissues. Skeletal muscle cells sense this limitation in glucose availability and transform this information into transcriptional and metabolic adaptations. Here we demonstrate that AMPK acts as the prime initial sensor that translates this information into SIRT1-dependent deacetylation of the transcriptional regulators PGC-1alpha and FOXO1, culminating in the transcriptional modulation of mitochondrial and lipid utilization genes. Deficient AMPK activity compromises SIRT1-dependent responses to exercise and fasting, resulting in impaired PGC-1alpha deacetylation and blunted induction of mitochondrial gene expression. Thus, we conclude that AMPK acts as the primordial trigger for fasting- and exercise-induced adaptations in skeletal muscle and that activation of SIRT1 and its downstream signaling pathways are improperly triggered in AMPK-deficient states.

Universal proteomics sample preparation is challenging because of the high heterogeneity of biological samples. Here we describe a novel mechanism that exploits the inherent instability of denatured proteins for nonspecific immobilization on microparticles by protein aggregation capture. To demonstrate the general applicability of this mechanism, we analyzed phosphoproteomes, tissue proteomes, and interaction proteomes as well as dilute secretomes. The findings present a practical, sensitive and cost-effective proteomics sample preparation method. Universal proteomics sample preparation is challenging because of the high heterogeneity of biological samples. Here we describe a novel mechanism that exploits the inherent instability of denatured proteins for nonspecific immobilization on microparticles by protein aggregation capture. To demonstrate the general applicability of this mechanism, we analyzed phosphoproteomes, tissue proteomes, and interaction proteomes as well as dilute secretomes. The findings present a practical, sensitive and cost-effective proteomics sample preparation method. Dedicated sample preparation for shotgun proteomics is essential for removing impurities and interfering species which may affect peptide chromatography, ionization during the electrospray process, and sequencing by mass spectrometers. To represent the in vivo state of the global proteome including membrane-bound proteins, it is of high importance to ensure complete lysis of cells and tissues before protease digestion. This typically requires strong detergents that are difficult to remove afterward, however crucial to avoid signal interference during MS analysis. Considerable developments have been made based on a variety of different biochemical principles which use filters, traps, or protein precipitation techniques which address different sample types (1.Wiśniewski J.R. Zougman A. Nagaraj N. Mann M. Universal sample preparation method for proteome analysis.Nat. Methods. 2009; 6: 259Crossref Scopus (5043) Google Scholar, 2.Shevchenko A. Tomas H. Havli J. Olsen J.V. Mann M. In-gel digestion for mass spectrometric characterization of proteins and proteomes.Nat. Protoc. 2007; 1: 2856-2860Crossref Scopus (3531) Google Scholar, 3.Zougman A. Selby P.J. Banks R.E. Suspension trapping (STrap) sample preparation method for bottom-up proteomics analysis.Proteomics. 2014; 14: 1000-1006Crossref Scopus (173) Google Scholar). However, a primary challenge remaining is the development of a universal sample preparation method that has the potential to scale across different sample amounts, which typically range from ng to mg of starting material. Moreover, such a method needs to be compatible with different lysis buffers, biological material (i.e. cell lines, tissues), robust, reproducible, cost effective, and perhaps above all; practical. Although several methods have been developed to individually address different proteomics sample preparation challenges, a simple solution spanning all sample types remains elusive. Here we report a mechanism, termed protein aggregation capture (PAC) 1, which uses the phenomenon of nonspecifically immobilizing precipitated and aggregated proteins on any type of sub-micron particles irrespective of their surface chemistry. We explore the fundamental process underlying this phenomenon behind methods such as SP3 and determine the optimal parameters leading to effective sample preparation for shotgun proteomics analysis by mass spectrometry of different sample types. Our developments demonstrate the potential for low cost, simple, robust and sensitive sample preparation procedures for proteomics analysis, which can be easily implemented in any setting with great potential for full automation. Chemicals were purchased from Sigma-Aldrich (Søborg, Denmark) unless otherwise specified. 1 μm diameter Sera-mag carboxyl magnetic beads (cas # 45152105050250 and cas # 65152105050250) were purchased from GE-Healthcare (Brøndby, Denmark). 0.5 μm diameter SIMAG-Sulfon (cas # 1202), SiMAG-Q (cas # 1206), and SiMAG-Octadecyl (cas # 1301) magnetic beads were all purchased from Chemicell GmbH (Berlin, Germany). 5–10 μm average diameter HILIC, TiO2, and Ti-IMAC magnetic beads were purchased from ReSyn Biosciences (Edenvale, Gauteng, South Africa). Carbonyl-iron powder with 5–9 μm diameter grain size was purchased from Sigma-Aldrich (cas # 44890). Human bone osteosarcoma epithelial (U2OS) and human epithelial cervix carcinoma (HeLa) adherent cells were grown in DMEM media (Gibco, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts) supplemented with fetal bovine serum (Gibco) at 10% final. The media also contained penicillin (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific) at 50 U/ml and streptomycin (Invitrogen) at 100 μg/ml. Cells were grown in a humidified incubator at 37 °C with 5% CO2. In all cases, cells were grown to 80–90% confluency before harvesting with different lysis buffers in Nunc petridishes (100 or 150 mm diameter). To generate stably expressing GFP-TTP cells under a doxycycline inducible promoter, ZFP36/TTP was gateway cloned into a pCDNA4/TO/GFP expression vector by gateway cloning (Thermo Fisher Scientific), and co-transfected with pcDNA6/TR (Thermo Fisher Scientific) into U2OS cells. Cells were selected with zeocin and blasticidin for 14 days, after which individual clones were picked and screened for GFP-TTP expression. For SILAC labeling, cells were cultured in media containing either l-arginine and l-lysine (Light), l-arginine [13C6] and l-lysine [2H4] (Medium) or l-arginine [13C6-15N4] and l-lysine [13C6-15N2] (Heavy; Cambridge Isotope Laboratories, Tewksbury, Massachusetts). RAW264.7 macrophage cells were derived from Mus musculus and grown in 10% in DMEM media with 10% FBS in 150 mm diameter Nunc petridishes. The media was removed, and cells were washed with PBS before addition of phenol-red free DMEM media without serum, penicillin, and streptomycin. Cells were stimulated with lipopolysaccharids (LPS) with 1 μg/ml for 4 h. Four hundred microliters of the media was removed and processed for secretome analysis and filtered through 0.22 μm filter (Sartorius #16532) before further processing. Cells lysis as presented in this study was performed with either one of the three buffers: (1) 6 m guanidine hydrochloride in 100 mm tris hydrochloride (Life technologies, Carlsbad, California) at pH 8.5, (2) 1% SDS in 100 mm 100 mm Tris Hydrochloride (pH 8.5) or (3) 0.1% NP-40 in 1× phosphate buffered saline solution (pH 7.4) containing β-glycerol phosphate (50 mm), sodium orthovanadate (10 mm), and protease inhibitor mixture (Roche, Basel, Switzerland). In all cases, supernatant from adherent cell plates was removed and the cells were rinsed with ice cold 1× PBS before the addition of the lysis buffer. Guanidine hydrochloride buffer was pre-heated to 99 °C before the addition to the cell plates. After the addition of guanidine or SDS buffer, cells were manually collected and heated at 99 °C for 10 min followed by sonication using a probe to shear RNA and DNA. Proteins were immediately reduced and alkylated with the 10 mm tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) and 11 mm 2-chloroacetamide (CAA) for samples lysed with guanidine hydrochloride or SDS lysis buffer before further processing. For cells lysed using 0.1% NP-40 buffer, 1 μl of benzonase (≥250U/ul) was added to the lysis solution for 1 h on ice. The lysis solution was centrifuged at 5000 × g for 10 min and the supernatant was transferred to a new tube. GFP-TTP immunoprecipitations were performed using GFP-Trap magnetic agarose beads (Chromotek, Martinsried, Germany) according to manufacturer's instructions. Cell lysis and immunoprecipitations were carried out using low salt EBC lysis buffer (150 mm NaCl; 50 mm TRIS pH 7.5; 1 mm EDTA; 0,5% NP-40) for 1 h followed by 5 washes with the same buffer. Proteins were eluted by boiling in 2% SDS, 10% glycerol, 5% 2-mercaptoethanol, 0.1 m Tris-HCl (pH 6.8). Aggregation was induced by the addition of acetonitrile (unless stated otherwise) and magnetic microparticles were added to solution followed by mixing to uniformly mix the bead solution. The solution was allowed to settle for 10 min and beads were separated using a magnet for 60 s. Magnetic microspheres were retained by magnet and the supernatant was removed by vacuum suction. In the case of analysis by protein gel electrophoresis (SDS-PAGE), the supernatant was transferred to new tubes. Beads were washed using acetonitrile once followed by one wash with 70% ethanol. See extended methods for experiment specific protocols. Samples and washes were prepared for analysis by protein gel electrophoresis (SDS-PAGE) by the addition of 4× LDS sample buffer (Thermo Fisher Scientific) to 1× final, and DTT (100 mm). Samples were heated for 10 min at 80 °C. For eluting bead bound protein aggregates, LDS buffer (containing DTT) was added to bead containing solutions and the mixture was heated for 10 min at 80 °C. Heated beads in LDS buffer were separated by magnet and the supernatant was analyzed by SDS-PAGE or transferred to a new tube and stored at −20 °C until SDS-PAGE analysis. Samples were loaded on NuPAGE 4–12% Bis-Tris protein gel (Thermo Fisher Scientific) and ran with 200 volts for 40 min. Gels were stained for 15 min using instant Blue (Expedeon, San Diego, California) and destained overnight with Milli-Q water and scanned on EPSON V750 PRO. Proteins were aggregated on microspheres and washed as described above. For on-bead digestion, 50 mm HEPES buffer (pH 8.5) was added to submerge microspheres. Proteins were reduced and alkylated with the 5 mm tris(2-carboxyethyl)phosphine (TCEP) and 5.5 mm 2-chloroacetamide (CAA) for 30 min if not treated immediately after lysis. Lys-c (Wako Chemicals) was added at ratio of 1:200 (to protein) and allowed to react for 1 h at 37 °C followed by the addition of trypsin at a ratio of 1:100 (unless specified otherwise). Trypsin digestion was allowed to occur overnight at 37 °C. Beads were separated by magnet and the supernatant was transferred to new tube and acidified. In-solution digestion with guanidine hydrochloride buffer was carried out under similar reduction and alkylation conditions. Lys-c was added to solution and allowed to react for 1 h at 37 °C. The concentration of guanidine hydrochloride concentration was reduced to >1 M before the addition of trypsin for overnight digestion. Solution was acidified by with 1% trifluoroacetic acid (TFA) and centrifuged for 5 min at 5000 × g and the supernatant transferred to new tubes. Peptide mixtures were clarified with solid phase extraction. Briefly, hydrophobic C18 sep-pak (Waters Corporation, Taastrup, Denmark) were prepared by washing with acetonitrile and 0.1% TFA, followed by loading of the acidified peptide mixtures by gravity. Sep-paks were washed with 0.1% TFA and peptides were eluted using 50% Acetonitrile (0.05% TFA). Organic solvent was evaporated and peptides concentrated using a speedvac before MS analysis. We used skeletal muscle which were isolated for previously published study (See extended methods Schönke et al.). Frozen gastrocnemius muscles were crushed using mortar and pestle. Powdered muscle was homogenized using Ultra Turrax T8 homogenizer (IKA Labortechnik, Staufen im Breisgau, Germany) in 4% SDS buffer (100 mm Tris-HCl, pH 7.4). Protein lysates were boiled at 100 °C for 5 mins. Lysates were sonicated using a tip and centrifuged at 16,000 × g for 10 mins followed by reduction and alkylation as described above, the supernatant was then processed using FASP or PAC or frozen until further analysis. Urea powder was added to 400 μl of filtered cell culture supernatant for a final 2 m concentration, and pH for digestion adjusted with 40 μl Tris 1 m pH 8.5. FASP protocol was adapted from as previously described (1.Wiśniewski J.R. Zougman A. Nagaraj N. Mann M. Universal sample preparation method for proteome analysis.Nat. Methods. 2009; 6: 259Crossref Scopus (5043) Google Scholar). Samples were heated for 10 min at 56 °C and centrifuged (7000 × g, 10 min). Following centrifugation steps were performed applying the same conditions. Ultracel-30 membrane filters (#MRCF0R030, Millipore, Burlington, Massachusetts) were cleaned with 10% acetonitrile and 15% methanol, filters were centrifuged and equilibrated with 200 μl urea buffer (2 m, 0.1 m Tris, pH8.5), and centrifuged again. Samples were added into the filters and the filters were centrifuged and washed two times with urea buffer. Reduction was performed by 1 μl of 0.5 m TCEP in 100 μl urea buffer. The device was centrifuged, and alkylation was performed by 1 μl of 550 mm CAA in 100 μl urea buffer for 30 min in the dark. Filters were centrifuged and 200 μl urea buffer was added before another centrifugation. Subsequently, 4 μl of 0.5 μg/μl lys-c in 40 μl urea buffer was added for 3h at 37 °C with gentle orbital shaking. 4 μl of 0.5 μg/μl trypsin was added for an overnight digestion in the wet chamber at 37 °C with gentle orbital shaking. 1.5 ml eppendorf tubes were cleaned with absolute methanol and air dried, before inserting the filter device, which was then centrifuged. Subsequently 40 μl of milli-Q water was added followed by centrifugation. The enzymatic digestion was stopped by acidifying the sample to pH < 2.5 with TFA. StageTipping was performed right after. All following chemicals have the same references and concentrations as in the FASP sample preparation. Urea powder was added to 400 μl of filtered (0.22 uM) cell culture supernatant for a final 2 m concentration, and pH for digestion adjusted with 40 μl Tris 1 m pH8.5. 100% v/v. TCEP was added and the tubes were incubated for 30 min. Subsequently, samples were incubated with CAA for 20 min in the dark. The digestion step included addition of lys-c, incubation during 3h, followed by the addition trypsin (0.5 μg/μl), and incubation overnight at room temperature. The enzymatic digestion was stopped by acidifying the sample to pH < 2.5 with TFA. Samples were desalted and concentrated using Stage-Tips. In-gel protein digestion and downstream processing was performed as described earlier (Lundby and Olsen 2011, see references in extended supplementary methods). Adherent HeLa cells were grown as described above. Cells were washed and serum starved (DMEM without FBS) for 4 h followed by 10 min stimulation with FBS (10%). Cells were rapidly washed and lysed using guanidine hydrochloride buffer as described above. Protein concentration was estimated using tryptophan assay. Lys-C and trypsin digestion was carried out as described above. Peptides were clarified using SPE as described above with the exception that the peptide mixture was not concentrated using a speedvac. Small aliquat representing 5% was removed for determining peptide concentration using nanodrop which was estimated to roughly 200 μg. Ultra high phosphopeptide enrichment efficiency was achieved using Ti-IMAC magnetic beads (ReSyn Biosciences) with slight modification to the manufacturer protocol (see extended supplementary methods). Phosphopeptide containing solution were loaded onto C18 STAGE-tips where the phosphopeptides were loaded and washed. The STAGE-tips were stored at 4 °C until elution and analysis by MS. Samples were injected on a 15 cm nanocolumn (75 μm inner diameter) packed with 1.9 μm C18 beads (Dr. Maisch GmbH, Entringen, Germany) using an Easy-LC 1200 (Thermo Fisher Scientific). Peptides were separated and eluted from the column with an increasing gradient of buffer B (80% acetonitrile, 0.1% formic acid) at a flow rate of 250 nL/minute. All samples were analyzed on a Q-Exactive HF-X (Thermo Fisher Scientific) mass spectrometer coupled to EASY-nLC 1200. Except for two replicates of in-gel TTP pulldown and one replicate from PAC TTP pulldown experiments were analyzed on a Lumos (Thermo Fisher Scientific) mass spectrometer with similar scan settings. The mass spectrometer was operated in positive mode with TopN method. All mass spectrometric data are available via ProteomeXchange with identifier PXD011677. Raw files generated from LC/MS/MS experiments were analyzed using MaxQuant (1.6.1.1) software (Cox and Mann 2008). Samples generated from human cell lines (HeLa and U2OS) were searched against the reviewed Swiss-Prot human proteome (proteome ID: UP000005640, release date March 2018) with 21006 entries. Samples generated from mouse cell lines (Raw264.7) and tissue were searched against the Mus musculus reviewed Swiss-Prot proteome (proteome ID: UP000000589, release date October 2018) with 22325 entries. The protease specificity was set to "Trypsin/P" with maximum number of missed cleavages set to 2 with the exception for the analysis of protease digestion efficiency experiment, where it was set to "semi-tryptic" search. All searches were performed with carbamidomethyl of cysteines as a fixed modification whereas methionine oxidation and protein n-terminus acetylation were set as variable. Phosphorylation of serine, threonine, and tyrosine were set as variable modification for analysis of phosphopeptide enriched samples using Ti-IMAC. Maximum number of modifications was set to 5 for all analysis. Mass tolerance of 20 parts per million (ppm) was set to the first search of precursor ions followed by 4.5 ppm for main search after mass calibration. 20 ppm mass tolerance was set for fragment ion series. Minimum peptide length of 7 amino acids was required for all identifications and modified peptides required a minimum Andromeda score of 40 be considered for identification. A false discovery rate (FDR) of 1% was used for peptide spectral matches, peptides, and proteins. Proteins had to be identified by minimum of 2 peptides to be counted. Match between runs feature was used only for the analysis of phosphopeptide enriched samples. Number of replicates were denoted by "n = x" for all results where statistical analysis was performed and marked in the figures. Figure Legends provided further clarification of statistical tests and criteria for determining significance in each case. Analysis of protease efficiency were performed in duplicates for the two digestion methods (in solution versus PAC) with 25 different protease conditions for each, resulting in the analysis of 100 samples. One replicate from PAC digestion with no Lys-C and Trypsin at 1:50 ratio was discarded because of experimental error. Same biological source was used to limit the variation only to the sample preparation methods. For phosphoproteomics analysis (as presented in Fig. 3B, 3C, 3D), same HeLa protein extract was used to limit the variation to the sample preparation conditions. The protein extract was equally aliquated 8 times for quadruplicate analysis of digestion methods (in solution versus PAC) leading to 8 different samples. Each sample was independently prepared (in solution or PAC) followed by independent enrichment of phosphopeptides from each sample after protease digestion. Skeletal tissue protein extract was aliquated 6 times for triplicate analysis of peptide recovery and proteomics analysis between FASP and PAC. Each replicate was prepared and analyzed separately. SILAC analysis of ZFP36 (Tristetraprolin or TTP) interactors was performed in quadruplicates by growing cells in light, medium, and heavy states in 4 different cell culture plates (for a total of 12 different plates) and mixed to produce 4 separate samples from which ZFP36 interactors were determined. Elution from GFP-Trap beads were evenly split into half for either in-gel or PAC analysis. Quantile normalization was used to synchronize protein intensities and SILAC ratio distributions across replicates and experiments (see extended methods, Amaratunga et al. and Bolstad et al.). Secretome analysis of RAW264.7 macrophage cells was performed in quadruplicates by growing the cells in 4 separate cell culture Petri dishes. The supernatant from each replicate was prepared independently for proteomics analysis by FASP, in solution, or PAC method. Our hypothesis was based on a series of reports and observations that lead us to conclude the mechanism of nonspecific aggregation, initially on magnetic beads with carboxyl group surface chemistries. Carboxyl coated magnetic beads have been reported for sensitive proteomics sample preparation as an alternative to other approaches such as FASP with limited starting material (4.Hughes C.S. Foehr S. Garfield D.A. Furlong E.E. Steinmetz L.M. Krijgsveld J. Ultrasensitive proteome analysis using paramagnetic bead technology.Mol. Syst. Biol. 2014; 10: 757Crossref PubMed Scopus (513) Google Scholar). The binding mechanism was attributed to hydrophilic interactions (HILIC)(5.Alpert A.J. Hydrophilic-interaction chromatography for the separation of peptides, nucleic acids and other polar compounds.J. Chromatogr. A. 1990; 499: 177-196Crossref PubMed Scopus (1685) Google Scholar) with the carboxyl surface groups and the method was termed "SP3," recent improvements of the protocol, such as pH control have rendered it more practical (6.Sielaff M. Kuharev J. Bohn T. Hahlbrock J. Bopp T. Tenzer S. Distler U. Evaluation of FASP, SP3, and iST protocols for proteomic sample preparation in the low microgram range.J. Proteome Res. 2017; 16: 4060-4072Crossref PubMed Scopus (132) Google Scholar, 7.Moggridge S. Sorensen P.H. Morin G.B. Hughes C.S. Extending the compatibility of the SP3 paramagnetic bead processing approach for proteomics.J. Proteome Res. 2018; 17: 1730-1740Crossref PubMed Scopus (112) Google Scholar, 8.Hughes C.S. Moggridge S. Müller T. Sorensen P.H. Morin G.B. Krijgsveld J. Single-pot, solid-phase-enhanced sample preparation for proteomics experiments.Nat. Protocols. 2018; 14: 68-85Crossref Scopus (377) Google Scholar). As HILIC principles dictate preferential polar and ionic interactions under nonaqueous conditions, protein interaction to the carboxyl surface of the beads was hypothesized to be induced by the addition of acetonitrile to the protein lysate. However, we observed that stringent binding of proteins to the microspheres could not be completely reversed under aqueous conditions even with extended washing (Fig. 1A Supplemental Fig. S1). Proteins however could be released in solubilization buffers such as lithium dodecyl sulfate (Fig. 1A). We therefore wondered whether protein immobilization could additionally be driven by aggregation of insoluble proteins on magnetic microspheres. To test this, we treated native protein lysates either by incubation at room temperature (25 °C) where proteins should stay in their native state, or induced aggregation by three different known mechanisms, these being organic solvent (acetonitrile; 70% final), high temperature (80 °C) for 5 min, or high salt (2.5 m ammonium sulfate), followed by the addition of magnetic carboxyl microspheres. Immobilization of aggregated and insoluble proteins was only observed under the three conditions known to induce aggregation, indicating that protein aggregation was essential to the underlying mechanism of protein capture (Fig. 1B). Importantly, the induced protein aggregation was very effective–especially using acetonitrile–as judged by the little protein amounts remaining in the supernatants. We subsequently investigated the role of microsphere surface chemistry on protein immobilization and found no impact on protein aggregation irrespective of microsphere surface chemistry including those containing hydrophobic C18 surfaces (Fig. 2A). To rule out the role of the magnetic properties of the microspheres leading to immobilization, we tested protein aggregation on porous 3 μm C18 hydrophobic beads, which are typically used for packing reversed-phase nano-columns and found similar immobilization mechanisms ( supplemental Fig. S1 B). We further examined whether coated smooth surface microspheres were essential for protein immobilization by inducing protein aggregation (with acetonitrile) on fine iron powder microparticles (grain size 5–9 μm) and observed aggregation in a similar manner (Supplemental Fig. S1 C). However, because of the poor solubility of carbonyl powder (in water or water/organic solvent mix) the recovery was found to be less reproducible resulting in low protein aggregation especially as the volume of protein containing solutions were scaled higher (data not shown). Further, we tested the order addition of beads and solvent and found no noticeable effect of protein aggregation capture on beads (supplemental Fig. S1D). We next inquired whether protein aggregation on microspheres was a function of microparticle surface area by gauging protein aggregation at very low microsphere concentrations relative to a constant concentration of protein lysate at 0.25 μg/μl (Fig. 2B). Although very low amounts of beads were enough to aggregate proteins from solution (Fig. 2B), we found the structural integrity of visible protein-bead precipitate to be unstable when the bead to protein ratio was less than 1:4, leading to dispersion of small aggregated pieces in solution upon mild disruption. Conversely, solutions with low protein concentrations (<0.075 μg/μl) were found to require higher bead to protein ratios for efficient capture and recovery (supplemental Fig. S1D, S1E). These results indicate that solutions with higher protein concentrations can aggregate on minute amounts of microparticles, however lower protein concentration require relatively higher amounts of microparticles to effectively capture aggregated proteins. Collectively the data suggest that microparticle surface (irrespective of surface chemistry) acts as a nucleation site or carrier to induce a immobilization cascade of insoluble protein aggregates, which ultimately serve to tightly maintain a microparticle-protein structure (Fig. 2C). We assessed the impact on trypsin digestion efficiency of immobilized proteins on carboxyl coated microparticles and compared it to a commonly-used chaotropic agent based in-solution digestion protocol (9.Poulsen J.W. Madsen C.T. Young C. Poulsen F.M. Nielsen M.L. Using guanidine-hydrochloride for fast and efficient protein digestion and single-step affinity-purification mass spectrometry.J. Proteome Res. 2013; 12: 1020-1030Crossref PubMed Scopus (32) Google Scholar). Analyzing all samples by single shot nanoflow liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) we found significantly reduced number of missed tryptic cleavages between the two methods at different Lys-C and Trypsin ratios (Fig. 3A, supplemental Fig. S2A, supplemental Table S1). These findings imply the possibility to considerably reduce proteomics sample preparation costs as proteases typically constitute one of the largest expense of the workflow before MS analysis. As previously determined by missed cleavages across different digestion protocols (10.Ludwig K.R. Schroll M.M. Hummon A.B. Comparison of in-solution, FASP, and S-trap based digestion methods for bottom-up proteomic studies.J. Proteome Res. 2018; 17: 2480-2490Crossref PubMed Scopus (89) Google Scholar), our results indicate that 10–20x reduction in Trypsin and Lys-C usage (1:500–1:1000 ratio) leads to comparable missed cleavage rates (below 30%) to the standard 1:50 trypsin-to-protein ratio used in most proteomics studies (Fig. 3A, supplemental Fig. 2A). Post-translational modifications (PTMs) such as site-specific phosphorylation can rapidly modulate the function of proteins by changing their enzymatic activity, subcellular localization, turnover, and interaction partners (11.Olsen J.V. Blagoev B. Gnad F. Macek B. Kumar C. Mortensen P. Mann M. Global, in vivo, and site-specific phosphorylation dynamics in signaling networks.Cell. 2006; 127: 635-648Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2810) Google Scholar). It is therefore important to develop proteomics methods that enable global analysis of phosphoproteomes in a robust, reproducible and sensitive manner. We examined whether the analysis of protein phosphorylation status is affected by the on-bead protein aggregation capture workflow on serum stimulated HeLa cells. Phosphopeptides were enriched by magnetic Ti-IMAC beads and the eluates analyzed by LC-MS/MS in turn. The results demonstrate no impact in the number of identified phosphorylated peptide variants and phosphorylation sites (Fig. 3B, 3C, supplemental Table S2). Importantly, >1000 more phosphorylated peptides and 779 localized sites were identified on average using microsphere protein aggregation followed by protease digestion compared with standard in-solution digestion. Moreover, high degree of overlap for localized sites was found between the two methods (Fig. 3C) and no bias in the phosphopeptide enrichment was observed between the two experiments as we achieved an enrichment efficiency >99% for all replicates (supplemental Fig. S2B). Surprisingly, we did not observe a major difference between missed cleavage rates for phosphopeptides between the two methods (supplemental Fig. S2C). We next assessed the potential of using magnetic microparticles for proteomics analysis of organs and tissues. This can be particularly challenging as it often requires harsh solubilization buffers for efficient protein extraction from hard and soft tissues. To test aggregation on microparticles we used skeletal muscle tissue samples from Mus musculus. After homogenization and solubilization in 4% SDS lysis buffer, we examined protein recovery and digestion by using either the established filter-aided sample preparation (FASP) protocol or via aggregation of proteins on magnetic microspheres with sulfonic acid surface chemistry. Significantly higher peptide recovery (>2 fold) after Lys-C/Trypsin digestion was observed using microspheres from initial starting material of 1.8 mg (as determined by tryptophan assay) (12.Wiśniewski J.R. Gaugaz F.Z. Fast and sensitive total protein and peptide assays for proteomic analysis.Anal. Chem.

Skeletal muscle constitutes 40% of individual body mass and plays vital roles in locomotion and whole-body metabolism. Proteomics of skeletal muscle is challenging because of highly abundant contractile proteins that interfere with detection of regulatory proteins. Using a state-of-the art MS workflow and a strategy to map identifications from the C2C12 cell line model to tissues, we identified a total of 10,218 proteins, including skeletal muscle specific transcription factors like myod1 and myogenin and circadian clock proteins. We obtain absolute abundances for proteins expressed in a muscle cell line and skeletal muscle, which should serve as a valuable resource. Quantitation of protein isoforms of glucose uptake signaling pathways and in glucose and lipid metabolic pathways provides a detailed metabolic map of the cell line compared with tissue. This revealed unexpectedly complex regulation of AMP-activated protein kinase and insulin signaling in muscle tissue at the level of enzyme isoforms. Skeletal muscle constitutes 40% of individual body mass and plays vital roles in locomotion and whole-body metabolism. Proteomics of skeletal muscle is challenging because of highly abundant contractile proteins that interfere with detection of regulatory proteins. Using a state-of-the art MS workflow and a strategy to map identifications from the C2C12 cell line model to tissues, we identified a total of 10,218 proteins, including skeletal muscle specific transcription factors like myod1 and myogenin and circadian clock proteins. We obtain absolute abundances for proteins expressed in a muscle cell line and skeletal muscle, which should serve as a valuable resource. Quantitation of protein isoforms of glucose uptake signaling pathways and in glucose and lipid metabolic pathways provides a detailed metabolic map of the cell line compared with tissue. This revealed unexpectedly complex regulation of AMP-activated protein kinase and insulin signaling in muscle tissue at the level of enzyme isoforms. Skeletal muscle is a highly specialized tissue that plays a fundamental role in locomotion and is indispensable in regulating whole-body carbohydrate metabolism. This tissue alone accounts for about 75% of insulin-stimulated glucose uptake (1DeFronzo R.A. Gunnarsson R. Bjorkman O. Olsson M. Wahren J. Effects of insulin on peripheral and splanchnic glucose metabolism in noninsulin-dependent (type II) diabetes mellitus.J. Clin. Invest. 1985; 76: 149-155Crossref PubMed Scopus (885) Google Scholar). Skeletal muscle exhibits a remarkable plasticity and adapts to a wide range of stimuli such as exercise and nutrient supply (2Chibalin A.V. Yu M. Ryder J.W. Song X.M. Galuska D. Krook A. Wallberg-Henriksson H. Zierath J.R. Exercise-induced changes in expression and activity of proteins involved in insulin signal transduction in skeletal muscle: differential effects on insulin-receptor substrates 1 and 2.Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2000; 97: 38-43Crossref PubMed Scopus (170) Google Scholar, 3Booth F.W. Thomason D.B. Molecular and cellular adaptation of muscle in response to exercise: perspectives of various models.Physiol. Rev. 1991; 71: 541-585Crossref PubMed Scopus (557) Google Scholar, 4Hawley J.A. Adaptations of skeletal muscle to prolonged, intense endurance training.Clin. Exp. Pharmacol. Physiol. 2002; 29: 218-222Crossref PubMed Scopus (204) Google Scholar). Metabolism and function of skeletal muscle is severely affected in pathological conditions such as type 2 diabetes (5DeFronzo R.A. Bonadonna R.C. Ferrannini E. Pathogenesis of NIDDM. A balanced overview.Diabetes Care. 1992; 15: 318-368Crossref PubMed Scopus (1891) Google Scholar), neuromuscular disorders (6Lacomis D. Electrophysiology of neuromuscular disorders in critical illness.Muscle Nerve. 2013; 47: 452-463Crossref PubMed Scopus (54) Google Scholar), cancer cachexia (7Kadar L. Albertsson M. Areberg J. Landberg T. Mattsson S. The prognostic value of body protein in patients with lung cancer.Ann. N.Y. Acad. Sci. 2000; 904: 584-591Crossref PubMed Scopus (33) Google Scholar), age-related sarcopenia (8Evans W.J. What is sarcopenia?.J. Gerontol. A Biol. Sci. Med. Sci. 1995; 50: 5-8Crossref PubMed Google Scholar), muscular atrophy (9Mallinson J.E. Murton A.J. Mechanisms responsible for disuse muscle atrophy: potential role of protein provision and exercise as countermeasures.Nutrition. 2013; 29: 22-28Crossref PubMed Scopus (19) Google Scholar), and muscular dystrophy (10Campbell K.P. Three muscular dystrophies: loss of cytoskeleton-extracellular matrix linkage.Cell. 1995; 80: 675-679Abstract Full Text PDF PubMed Scopus (759) Google Scholar). MS-based proteomics has begun to advance molecular understanding of these muscle diseases (11Hojlund K. Yi Z. Hwang H. Bowen B. Lefort N. Flynn C.R. Langlais P. Weintraub S.T. Mandarino L.J. Characterization of the human skeletal muscle proteome by one-dimensional gel electrophoresis and HPLC-ESI-MS/MS.Mol. Cell. Proteomics. 2008; 7: 257-267Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (96) Google Scholar, 12Doran P. Yi Z. Hwang H. Bowen B. Lefort N. Flynn C.R. Langlais P. Weintraub S.T. Mandarino L.J. Proteome analysis of the dystrophin-deficient MDX diaphragm reveals a drastic increase in the heat shock protein cvHSP.Proteomics. 2006; 6: 4610-4621Crossref PubMed Scopus (113) Google Scholar, 13Parker K.C. Walsh R.J. Salajegheh M. Amato A.A. Krastins B. Sarracino D.A. Greenberg S.A. Characterization of human skeletal muscle biopsy samples using shotgun proteomics.J. Proteome Res. 2009; 8: 3265-3277Crossref PubMed Scopus (60) Google Scholar). However, most of these pioneering studies had limited proteome coverage and lacked robust quantitation (14Ohlendieck K. Proteomics of skeletal muscle differentiation, neuromuscular disorders, and fiber aging.Expert Rev. Proteomics. 2010; 7: 283-296Crossref PubMed Scopus (49) Google Scholar). Significant technological advances over the last decade now allow near exhaustive analysis of cell line proteomes (15Nagaraj N. Wisniewski J.R. Geiger T. Cox J. Kircher M. Kelso J. Paabo S. Mann M. Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line.Mol. Syst. Biol. 2011; 7: 548Crossref PubMed Scopus (750) Google Scholar, 16Beck M. Schmidt A. Malmstroem J. Claassen M. Ori A. Szymborska A. Herzog F. Rinner O. Ellenberg J. Aebersold R. The quantitative proteome of a human cell line.Mol. Syst. Biol. 2011; 7: 549Crossref PubMed Scopus (585) Google Scholar, 17Altelaar A.F. Munoz J. Heck A.J. Next-generation proteomics: towards an integrative view of proteome dynamics.Nat Rev Genet. 2013; 14: 35-48Crossref PubMed Scopus (521) Google Scholar). These advances have recently enabled the identification of several thousand proteins in muscle tissue preparations (18Geiger T. Velic A. Macek B. Lundberg E. Kampf C. Nagaraj N. Uhlen M. Cox J. Mann M. Initial quantitative proteomic map of 28 mouse tissues using the SILAC mouse.Mol. Cell. Proteomics. 2013; 12: 1709-1722Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (164) Google Scholar, 19Drexler H.C. Ruhs A. Konzer A. Mendler L. Bruckskotten M. Looso M. Gunther S. Boettger T. Kruger M. Braun T. On marathons and sprints: an integrated quantitative proteomics and transcriptomics analysis of differences between slow and fast muscle fibers.Mol. Cell. Proteomics. 2012; 11 (M111 010801)Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (71) Google Scholar). However, the challenging dynamic range of protein expression in tissues in general and in muscle in particular has so far prevented measurement of very deep proteomes that would also cover the low abundance, regulatory proteins. The C2C12 is an immortalized mouse myoblast cell line that can readily be differentiated to myotubes in culture and is commonly used as a model system for investigating molecular, biochemical, or pathological changes of skeletal muscle (20Tsuchiya Y. Hatakeyama H. Emoto N. Wagatsuma F. Matsushita S. Kanzaki M. Palmitate-induced down-regulation of sortilin and impaired GLUT4 trafficking in C2C12 myotubes.J. Biol. Chem. 2010; 285: 34371-34381Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (60) Google Scholar, 21Sharples A.P. Al-Shanti N. Stewart C.E. C2 and C2C12 murine skeletal myoblast models of atrophic and hypertrophic potential: relevance to disease and aging?.J. Cell. Physiol. 2010; 225: 240-250Crossref PubMed Scopus (51) Google Scholar, 22Watanabe T. Sasagawa N. Usuki F. Koike H. Saitoh N. Sorimachi H. Maruyama K. Nakase H. Takagi A. Ishiura S. Suzuki K. Overexpression of myotonic dystrophy protein kinase in C2C12 myogenic culture involved in the expression of ferritin heavy chain and interleukin-1alpha mRNAs.J. Neurol. Sci. 1999; 167: 26-33Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (4) Google Scholar). Although these cells express sarcomeric proteins and can develop contractile properties in culture, they lack the 3D structure and specialized muscle functions characteristic of the tissue context. Here we measured a very deep proteome of the C2C12 myotubes and transfer the peptide and protein identifications to a data set obtained under the same conditions from adult mouse skeletal muscle. This strategy allowed us to obtain the largest skeletal muscle proteome so far and to highlight similarities and differences between these two model systems. We further quantitatively mapped the protein isoforms of glucose uptake signaling pathways, key metabolic pathways, and muscle specific transcription factors. Although we choose to present quantitation of these selected proteins and pathways because of their central role in muscle function, our approach could be applied to any protein or pathway as well as expanded to other challenging tissues. All animal experiments were approved by Danish Animal Experimental Inspectorate in compliance with the European Convention for Protection of Vertebrate Animal Used for Scientific Purposes. Fifteen-week-old female C57BL/6 mice were maintained on a 12:12-h light-dark cycle and had free access to standard chow diet. Triceps muscles were surgically removed from the anesthetized mice and quickly frozen in liquid nitrogen followed by storage at −80 °C. C2C12 cells (myoblasts) were grown in Eagle's minimum essential medium supplemented with 2 mm l-glutamine and 10% fetal bovine serum plus antibiotics in a humidified atmosphere with 5% CO2 in air. Undifferentiated myoblasts were grown to confluence in normal growth media (day 0). To induce differentiation, the amount of serum in the media was decreased to 2%. Cells were differentiated for 8 days. Growth medium was replaced with fresh medium every 2 days over a period of 8 days. At day 8 post differentiation, we observed less than 5% cell death (Tryphan blue staining). After 8 days, differentiated C2C12 (myotubes) were harvested for proteomics analysis. Triceps muscle and differentiated C2C12 cells were lysed in buffer consisting of 0.1 m Tris-HCl, pH 7.5, 0.1 m DTT, and 4% SDS, and incubated at 95 °C for 5 min. Triceps muscle homogenization was achieved with Ultra Turbax blender (IKA, Staufen, Germany). Lysates were sonicated using a Branson type sonicator and were then clarified by centrifugation at 16,100 × g for 10 min. Cell lysates were diluted in 8 m urea in 0.1 m Tris-HCl followed by protein digestion with trypsin according to the FASP 1The abbreviations used are:FDRfalse discovery rateFASPfilter-aided sample preparationHCDHigher-energy collisional dissociation. protocol (23Wisniewski J.R. Zougman A. Nagaraj N. Mann M. Universal sample preparation method for proteome analysis.Nat. Methods. 2009; 6: 359-362Crossref PubMed Scopus (5042) Google Scholar). After an over-night digestion peptides were eluted from the filters with 25 mm ammonium bicarbonate buffer. From each sample, 100 μg of peptides were fractionated by isoelectric focusing on an OffGel fractionator (Agilent, Santa Clara, USA) in 12 well formats as described (24Hubner N.C. Ren S. Mann M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.Proteomics. 2008; 8: 4862-4872Crossref PubMed Scopus (147) Google Scholar). Peptides from each of the 12 fractions were purified on C18 StageTips. false discovery rate filter-aided sample preparation Higher-energy collisional dissociation. Analysis was performed in triplicates. Samples were measured using LC-MS instrumentation consisting of an Easy nano-flow HPLC system (Thermo Fisher Scientific, Odense, Denmark) coupled via a nanoelectrospray ion source (Thermo Fisher Scientific, Bremen, Germany) to a Q Exactive mass spectrometer (25Michalski A. Damoc E. Hauschild J.P. Lange O. Wieghaus A. Makarov A. Nagaraj N. Cox J. Mann M. Horning S. Mass spectrometry-based proteomics using Q Exactive, a high-performance benchtop quadrupole Orbitrap mass spectrometer.Mol. Cell. Proteomics. 2011; 10 (M111 011015)Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (626) Google Scholar). Purified peptides were separated on 50 cm C18 columns (inner diameter 75 μm, 1.8 μm beads, Dr, Maisch GmbH, Germany). Peptides were loaded onto the column with buffer A (0.5% formic acid) and eluted with a 150 min linear gradient from 2–30% buffer B (80% acetonitrile, 0.5% formic acid). After the gradient the column was washed with 90% buffer B and re-equilibrated with buffer A. Mass spectra were acquired in a data-dependent manner, with automatic switching between MS and MS/MS using a top-10 method. MS spectra were acquired in the Orbitrap analyzer with mass range of 300–1750 m/z and 70,000 resolutions at m/z 200. HCD1 peptide fragments acquired at 25 normalized collision energy were analyzed at high resolution in the Orbitrap. Raw MS files were analyzed by MaxQuant version 1.3.7.4 (26Cox J. Mann M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p. p. b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.Nat. Biotechnol. 2008; 26: 1367-1372Crossref PubMed Scopus (9150) Google Scholar) (http://www.maxquant.org). MS/MS spectra were searched by the Andromeda search engine (27Cox J. Neuhauser N. Michalski A. Scheltema R.A. Olsen J.V. Mann M. Andromeda: a peptide search engine integrated into the MaxQuant environment.J. Proteome Res. 2011; 10: 1794-1805Crossref PubMed Scopus (3448) Google Scholar) against the decoy UniProt-mouse database (Version June 2012, 59,345 entries) supplemented with 262 frequently observed contaminants and forward and forward and reverse sequences. In the main Andromeda search precursor mass and fragment mass were identified with an initial mass tolerance of 6 ppm and 20 ppm, respectively. The search included variable modifications of methionine oxidation and N-terminal acetylation, and fixed modification of carbamidomethyl cysteine. Minimal peptide length was set to seven amino acids and a maximum of two mis-cleavages was allowed. When we checked for the occurrence of demidation, we found it to be negligible (supplemental Fig. S6, supplemental Table S9). We therefore did not include it as a variable modification. The false discovery rate (FDR1) was set to 0.01 for peptide and protein identifications. MS runs from skeletal muscle were analyzed with or without the "match between runs" option. For matching, a retention time window of 30 s was selected. In the case of identified peptides that are all shared between two proteins, these were combined and reported as one protein group. Proteins matching to the reverse database were filtered out. For the proteins that were identified with single peptide, detailed information about the MSMS spectrum, peptide sequence, precursor m/z is provided (supplemental Table S8 and supplemental Fig. S5). All bioinformatics analysis was performed with the Perseus software (http://www.perseus-framework.org). Categorical annotation was supplied in form of Gene Ontology (GO) biological process (BP), molecular function (MF), and cellular component (CC), as well as participation in a KEGG pathway. All annotations were extracted from UniProt database. Hierarchical clustering and 2D annotation enrichment were based on label-free quantitation of the samples (28Cox J. Hein M.Y. Luber C.A. Paron I. Nagaraj N. Mann M. MaxLFQ allows accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction.Mol. Cell. Proteomics. 2014; 13: 2513-2526Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2687) Google Scholar). Because of randomness of peptide sampling in shotgun proteomics, quantification will be missing in some samples for each protein. In order to retain sufficiently informative protein expression profiles for bioinformatics analysis, the protein expression data was filtered to have at least two valid abundance values in at least one group (muscle or C2C12). The data was inputed to fill missing abundance values by drawing random numbers from a Gaussian distribution with a standard deviation of 30% in comparison to the standard deviation of measured protein abundances, and one standard deviation downshift of the mean. These parameters have been tuned in order to best simulate the distribution of low abundant proteins. These values are universally applied to nearly all data sets that were generated with the label-free quantitation algorithm. Two sample t test were performed on muscle and C2C12 groups with FDR = 0.05. Hierarchical clustering of significantly different proteins was performed after z-score normalization. We then performed Fisher exact test on particular clusters, testing for enrichment or depletion of any annotation term in the cluster compared with the whole matrix. The specific test used is a two-dimensional version of the nonparametric Mann-Whitney test. Multiple hypothesis testing was controlled by using a Benjamini-Hochberg false discovery rate threshold of 5%. Fisher exact test was performed with an FDR value of 0.04. Categorical annotations are supplied in the form of GOCC, GOMF, GOBP, and KEGG. A two-dimensional two-sample test was performed to find the significant differences between the two-dimensional means of the two protein populations (skeletal muscle and C2C12 myotubes). The nonparametric Mann-Whitney test was used. Multiple hypothesis testing was controlled by using a Benjamini-Hochberg FDR threshold of 5%. For categories that are significant, a two-dimensional difference score was calculated by determining the average rank of the protein abundance belonging to the corresponding annotation category. This average rank was then rescaled to the interval between −1 and 1. A value of 1 in one of the dimensions would mean that all members of this category are the largest values in this dimensions, whereas a value of 0 means that the ranks of the members of the category are distributed in same way as the background proteins having no significant bias toward larger or smaller values. For detailed explanation of the rank and scaling of 2D score between 1 to −1, please refer to (29Cox J. Mann M. 1D and 2D annotation enrichment: a statistical method integrating quantitative proteomics with complementary high-throughput data.BMC Bioinformatics. 2012; 13: S12Crossref PubMed Scopus (413) Google Scholar). Absolute protein abundance (mass) was calculated as described before (30Wisniewski J.R. Ostasiewicz P. Dus K. Zielinska D.F. Gnad F. Mann M. Extensive quantitative remodeling of the proteome between normal colon tissue and adenocarcinoma.Mol. Syst. Biol. 2012; 8: 611Crossref PubMed Scopus (188) Google Scholar). Briefly, the mass spectrometric signal of an individual protein was divided by the sum of all proteins. Because the resulting values were small, we multiplied them by 1 million and expressed absolute abundance as part-per-million (ppm) (Figs. 5, 6, and supplemental Table I). In other words, the absolute protein abundance described here is the fractional signal of each protein in relation to the total protein signal and hence is expressed in ppm. Quantifiable proteins in the analysis of skeletal muscle and C2C12 myotubes were defined as those identified at least two times in each group. Error bars in Figures 5, 6, and supplemental Fig. S4 denote standard deviation of median. In Table SI, quantifiable proteins were defined as those identified at least two times in skeletal muscle. The absolute abundances that are provided were calculated for the list of the proteins identified after using "match between runs" (Table SI).Fig. 6A proteomic view of skeletal muscle metabolism. A, Schematic representation of glucose and lipid metabolism in skeletal muscle. B, Summed absolute abundance of glucose transporters (GLUT) and fatty acid transporters (FAT). C, Absolute abundance of glycogen synthase (Gys), glycogen phosphorylase (Pyg) and glycogen synthase kinase 3 (Gsk3). D, Total abundance (%) of metabolic pathways. Total abundance is calculated by summing up absolute abundance of individual enzyme from respective pathways (supplemental Table S6). E and F, Percent contribution abundance of contractile proteins, metabolic pathways and other process in skeletal muscle and C2C12 myotubes. Error bars are standard deviation of median.View Large Image Figure ViewerDownload Hi-res image Download (PPT) The lysates from the muscle and C2C12 cells were electrophoresed, transferred to nitrocellulose, and probed for selected proteins. This analysis was performed on the very same lysate that were used for MS analysis (n = 2). The following antibodies were used: goat anti-AMPK alpha 2 (Santacruz, Dallas, USA), rabbit anti-HK II (Cell Signaling, Beverly, USA), rabbit anti-GLUT4 (Thermo scientific, Naerum, Denmark), and rabbit anti-GAPDH (Cell signaling, Beverly, USA). The anti-AMPK-a1 antibody (raised in sheep) was kindly provided by Prof. D. G. Hardie (University of Dundee, UK). In previous attempts at very deep proteome coverage of cell lines, we have employed protein level fractionation as well as several proteolytic enzymes (15Nagaraj N. Wisniewski J.R. Geiger T. Cox J. Kircher M. Kelso J. Paabo S. Mann M. Deep proteome and transcriptome mapping of a human cancer cell line.Mol. Syst. Biol. 2011; 7: 548Crossref PubMed Scopus (750) Google Scholar). However, recent experience in our laboratory suggested that single enzyme digestion and fractionation only at the peptide level, when coupled to advanced MS instrumentation, would be sufficient to achieve great depth of protein identification (31Geiger T. Wehner A. Schaab C. Cox J. Mann M. Comparative proteomic analysis of eleven common cell lines reveals ubiquitous but varying expression of most proteins.Mol. Cell. Proteomics. 2012; 11 (M111 014050)Abstract Full Text Full Text PDF Scopus (577) Google Scholar). We therefore developed a streamlined workflow, consisting of cell line or tissue homogenization, filter-aided sample preparation (FASP) (23Wisniewski J.R. Zougman A. Nagaraj N. Mann M. Universal sample preparation method for proteome analysis.Nat. Methods. 2009; 6: 359-362Crossref PubMed Scopus (5042) Google Scholar), followed by peptide separation into twelve fractions according to their isoelectric point as described (24Hubner N.C. Ren S. Mann M. Peptide separation with immobilized pI strips is an attractive alternative to in-gel protein digestion for proteome analysis.Proteomics. 2008; 8: 4862-4872Crossref PubMed Scopus (147) Google Scholar). Peptides were measured by a linear quadrupole-Orbitrap mass analyzer, which achieves sub or low parts per million mass accuracy for peptide ions and their fragments (25Michalski A. Damoc E. Hauschild J.P. Lange O. Wieghaus A. Makarov A. Nagaraj N. Cox J. Mann M. Horning S. Mass spectrometry-based proteomics using Q Exactive, a high-performance benchtop quadrupole Orbitrap mass spectrometer.Mol. Cell. Proteomics. 2011; 10 (M111 011015)Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (626) Google Scholar). This streamlined method required only 1 day of measurement time for a single analysis each of the proteomes and computational analysis followed by automated computational analysis in the MaxQuant environment (26Cox J. Mann M. MaxQuant enables high peptide identification rates, individualized p. p. b.-range mass accuracies and proteome-wide protein quantification.Nat. Biotechnol. 2008; 26: 1367-1372Crossref PubMed Scopus (9150) Google Scholar) (Fig. 1A–1C). We performed triplicate analyses of triceps muscles from C57BL/6J mice and of differentiated C2C12 cells and analyzed the results together in MaxQuant specifying a false discovery rate of 1% at the peptide and protein level. This identified a total of 10,218 proteins, a vastly larger number than reported in muscle proteome studies so far (Fig. 1D) (supplemental Table S1). A total of 8,309 proteins were identified in skeletal muscle, 9880 proteins in C2C12 myotubes, and 7,973 (78% of the total) proteins were identified in both systems. A mere 338 proteins were exclusively identified in the tissue. Interestingly, when skeletal muscle samples were analyzed separately, only 5,887 proteins were identified, whereas the corresponding number for myotubes was 9,624 (supplemental Table S2). This large difference is partially because of the complexity of the tissue and its large dynamic range, which makes MS analysis challenging. Peptides from a few highly abundant proteins of skeletal muscle interfere with the identification of lower abundant proteins, thereby reducing the overall number of identifications (Fig. 1B–1C). This is illustrated with a representative example from skeletal muscle: because of one high abundant peptide (originating from myosin), neighboring low abundant peptides are suppressed in comparison and may not be picked for fragmentation (Fig. 1B). This is not the case when analyzing C2C12 myotubes, where a larger number of peptides share approximately equal abundance and can all be fragmented and identified (Fig. 1C). Combined analysis of mouse skeletal muscle and C2C12 myotubes efficiently mitigated the challenge of dynamic range on protein identification in muscle tissue. MaxQuant aligned the retention times and–based on the accurately determined masses–efficiently transferred the peptide identification from C2C12 myotubes to more complex mouse skeletal muscle ("Match between runs" feature in MaxQuant). This identification, by matching is statistically controlled and high confidence of identification, is further indicated by the fact that 95% of the identified peptides were observed in a tight 0.4 min match time window (supplemental Fig. S1A). Altogether, this approach boosted protein identification by about 30%, which resulted in identification of 8,309 proteins in total in skeletal muscle (Fig. 1D–1E, supplemental Table S2). Most of proteins identified partially or exclusively by matching are of low abundance and include interesting regulatory classes such as skeletal muscle specific transcription factors (myod1, myog, mef2c), nuclear receptors (Smad1, Notch3), and circadian clock proteins (Bmal1, Cry1, Fbxl3) (supplemental Fig. S2A–S2B). Our experiment did not use isotope labeling but relied on label-free quantitation in the MaxQuant environment (28Cox J. Hein M.Y. Luber C.A. Paron I. Nagaraj N. Mann M. MaxLFQ allows accurate proteome-wide label-free quantification by delayed normalization and maximal peptide ratio extraction.Mol. Cell. Proteomics. 2014; 13: 2513-2526Abstract Full Text Full Text PDF PubMed Scopus (2687) Google Scholar). We examined reproducibility of this procedure between biological triplicates and found very high correlations within the skeletal muscle and C2C12 groups (0.9–0.96, supplemental Fig. S1B). Using summed MS-signals ("abundances") of the peptides identifying each protein in the MS measurements, we estimated their contribution to the proteome. For protein isoforms, the shared peptides were counted as contributing to each of them. To obtain a global view of the dynamic range of the muscle proteome, the C2C12 myotube proteome and their differences, we plotted the cumulative contribution of each protein to total protein mass (Fig. 2A) as well as the individual, ranked abundance (Fig. 2A, 2B; supplemental Table S3). Combining the abundances of all identified heavy and light myosin isoforms results in 18% of total muscle mass, positioning myosin as the highest abundant protein in skeletal muscle. The giant protein titin (390 kDa) alone accounts for another 16% of total protein mass. The 10 most abundant proteins according to MS measurement were titin, myosin-4, nebulin, calcium ATPase 1, actin α, creatine kinase, α-actinine-3, glycogen phosphorylase, and myosin-1 and together they make up 50% of total protein mass in skeletal muscle. Actin and myosin are the key members of the contractile units (sarcomere) in muscle. The estimated ratio between actin/myosin abundances was ∼1:7. The summed abundance of proteins that are assigned to the contractile machinery by Gene Ontology Cellular Compartment (GOCC) annotation was 53.6% of total protein mass for skeletal muscle. The ranked distribution of all individual proteins revealed a much steeper decline of abundances for the tissue compared with the cell line (Fig. 2B). In skeletal muscle, the lower half of the proteome accounts for a negligible fraction of its total mass (<0.1%). Our data also allows us to determine the amino acid make up of mouse muscle proteome as the weighted contribution from all identified protein sequences. For instance, branched chain amino acids, which are important in protein synthesis, constitute 20.5% of all amino acids weighted by protein abundance, which is similar to values in other mouse tissues (supplemental Fig. S3). Although almost all proteins identified in muscle were also identified in C2C12 myotubes, these two model systems turned out to be quit

Exercise is an effective strategy in the prevention and treatment of metabolic diseases. Alterations in the skeletal muscle proteome, including post-translational modifications, regulate its metabolic adaptations to exercise. Here, we examined the effect of high-intensity interval training (HIIT) on the proteome and acetylome of human skeletal muscle, revealing the response of 3168 proteins and 1263 lysine acetyl-sites on 464 acetylated proteins. We identified global protein adaptations to exercise training involved in metabolism, excitation-contraction coupling, and myofibrillar calcium sensitivity. Furthermore, HIIT increased the acetylation of mitochondrial proteins, particularly those of complex V. We also highlight the regulation of exercise-responsive histone acetyl-sites. These data demonstrate the plasticity of the skeletal muscle proteome and acetylome, providing insight into the regulation of contractile, metabolic and transcriptional processes within skeletal muscle. Herein, we provide a substantial hypothesis-generating resource to stimulate further mechanistic research investigating how exercise improves metabolic health.

SUMMARY Secreted proteins from adipose tissue play a role in metabolic cross-talk and homeostasis. We performed high sensitivity mass spectrometry-based proteomics on the cell media of in vitro differentiated, non-immortalized brown adipocytes derived from supraclavicular adipose of adult humans and white adipocytes derived from subcutaneous adipose of adult humans. We identified 471 potentially secreted proteins covering interesting protein categories such as hormones, growth factors, growth factor binding proteins, cytokines, extracellular matrix proteins, and proteins of the complement system, which were differentially regulated in brown and white adipocytes. A total of 101 proteins were exclusively quantified in brown adipocytes, among these ependymin-related protein 1 (EPDR1). Ablation of EPDR1 impaired the induction of thermogenic transcripts in response to norepinephrine in brown adipocytes, while EPDR1-treated mice increased their energy consumption, suggesting a role in brown fat commitment and activation. Our work reveals substantial differences between the secretomes of brown and white human adipocytes and identifies novel candidate batokines.

Abstract Defects in pancreatic islets and the progression of multi-tissue insulin resistance in combination with environmental factors are the main causes of type 2 diabetes (T2D). Mass spectrometry-based proteomics of five key-metabolic tissues on a cohort of 42 multi-organ donors provided deep coverage of the proteomes of pancreatic islets, visceral adipose tissue (VAT), liver, skeletal muscle and serum. Enrichment analysis of gene ontology (GO) terms built a tissue-specific map of the chronological order of altered biological processes across healthy controls (CTRL), pre-diabetes (PD) and T2D subjects. This unique dataset allowed us to explore alterations of entire biological pathways and individual proteins in multiple tissues. We confirmed the significant decrease of the citric acid cycle and the respiratory electron transport in VAT and muscle of T2D and we provided a thorough visual representation of the complete set of downregulated proteins. Importantly, we found widespread novel alterations in relevant biological pathways including the increase in hemostasis in pancreatic islets of PD, the increase in the complement cascade in liver and pancreatic islets of PD and the elevation in cholesterol biosynthesis in liver of T2D. Overall, our findings suggest inflammatory, immune and vascular impairments in pancreatic islets as potentially causal factors of insufficient insulin production and increased glucagon levels in the early stages of T2D. In contrast alterations in lipid metabolism and mitochondrial function in the liver and VAT/muscle, respectively, became evident later in manifest T2D. This first multi-tissue proteomic map indicates the temporal order of tissue-specific metabolic dysregulation in T2D development.

Abstract Skeletal muscle regulates glucose uptake in response to insulin and exercise which is critical for maintaining metabolic health. We conducted a comprehensive phosphoproteomic analysis of skeletal muscle from healthy people in response to an acute bout of exercise or insulin stimulation by a hyperinsulinemic euglycemic clamp. Our analysis revealed 233 phosphosites regulated by both exercise and insulin of which most phosphosites were regulated in opposite directions. However, 71 phosphosites on 55 proteins displayed regulation in the same direction, indicating a potential convergence of signaling pathways. We identified the vesicle-associated protein, REPS1, to be phosphorylated at Ser709 in response to both insulin and exercise. REPS1 protein level and Ser709 phosphorylation were closely related to insulin-stimulated glucose uptake in skeletal muscle and required for maximal insulin-stimulated glucose uptake. Furthermore, we observed that insulin triggered phosphorylation of REPS1 Ser709 via P90S6 kinase (RSK) and is impaired in mice and humans with insulin resistance. Collectively, REPS1 is a convergence point for insulin and exercise signaling and a promising therapeutic target in insulin resistance.

Universal proteomics sample preparation is challenging due to the high heterogeneity of biological samples. Here we describe a novel mechanism that exploits the inherent instability of denatured proteins for non-specific immobilization on microparticles by protein aggregation capture. To demonstrate the general applicability of this mechanism, we analyzed phosphoproteomes, tissue proteomes, and interaction proteomes as well as dilute secretomes. The findings presents a practical, sensitive and cost-effective proteomics sample preparation method.

Recent studies showed that patients suffering from lysosomal acid lipase deficiency (LAL-D) benefit from enzyme replacement therapy; however, liver histopathology improved in some but not all patients. We hypothesized that the pan-peroxisome proliferator-activated receptor agonist lanifibranor may have beneficial effects on liver inflammation in LAL knockout (Lal-/-) mice based on its promising results in alleviating liver inflammation in patients with metabolic dysfunction-associated steatohepatitis.

Abstract Highlights Advanced proteomics analysis reveals personalized signatures of insulin resistance Fasting muscle proteome and phosphoproteome predicts whole-body insulin sensitivity Insulin-stimulated phosphoproteome reveals selective insulin resistance signatures Phosphoproteome and proteome atlas explains sex-specific muscle metabolism Graphical Abstract Insulin resistance is a hallmark of type 2 diabetes, which is a highly heterogeneous disease with diverse pathology. Understanding the molecular signatures of insulin resistance and its association with individual phenotypic traits is crucial for advancing precision medicine in type 2 diabetes. Utilizing cutting-edge proteomics technology, we mapped the proteome and phosphoproteome of skeletal muscle from >120 men and women with normal glucose tolerance or type 2 diabetes, with varying degrees of insulin sensitivity. Leveraging deep in vivo phenotyping, we reveal that fasting proteome and phosphoproteome signatures strongly predict insulin sensitivity. Furthermore, the insulin-stimulated phosphoproteome revealed both dysregulated and preserved signaling nodes - even in individuals with severe insulin resistance. While substantial sex-specific differences in the proteome and phosphoproteome were identified, molecular signatures of insulin resistance remained largely similar between men and women. These findings underscore the need for precision medicine approaches in type 2 diabetes care, acknowledging disease heterogeneity.