Summary Alternative splicing events are a major causal mechanism for complex traits, but they have been understudied due to the limitation of short-read sequencing. Here, we generated a comprehensive full-length isoform annotation of human immune cells, Immune Isoform Atlas, by long-read sequencing for 29 cell subsets. Our atlas contained a number of unannotated transcripts and isoforms such as a read-through transcript of TOMM40-APOE . We profiled functional characteristics of isoforms including encoded domains, inserted repetitive elements, and translational efficiency, and we showed that repetitive elements significantly explained the diversity of unannotated isoforms. Some of the isoforms are expressed in a cell-type specific manner, whose alternative 3’-UTRs usage contributed to their specificity. Further, we identified a number of disease-associated isoforms by isoform switch analysis and by integration of several quantitative trait loci analyses with genome-wide association study data. Our findings will promote the elucidation of the pathomechanism of diseases via alternative splicing.

Abstract Alternative splicing events are a major causal mechanism for complex traits, but they have been understudied due to the limitation of short-read sequencing. Here, we generate a full-length isoform annotation of human immune cells from an individual by long-read sequencing for 29 cell subsets. This contains a number of unannotated transcripts and isoforms such as a read-through transcript of TOMM40-APOE in the Alzheimer’s disease locus. We profile characteristics of isoforms and show that repetitive elements significantly explain the diversity of unannotated isoforms, providing insight into the human genome evolution. In addition, some of the isoforms are expressed in a cell-type specific manner, whose alternative 3’-UTRs usage contributes to their specificity. Further, we identify disease-associated isoforms by isoform switch analysis and by integration of several quantitative trait loci analyses with genome-wide association study data. Our findings will promote the elucidation of the mechanism of complex diseases via alternative splicing.

ABSTRACT We have developed a centrifugal gel crushing method using a pipette tip. Polyacrylamide gel slices are extruded from the narrowing cavity of a pipette tip by centrifugation in a few minutes to crush them into pieces of appropriate size. The size of the crushed gel could be controlled by several parameters, including centrifugal force and pipette tip cavity. In shotgun proteomics, gel-based LC/MS/MS, so-called GeLC/MS/MS, involves the essential but tedious processes of pre-fractionation by SDS-PAGE, followed by dicing the entire gel lane into several parts, fine dicing, and in-gel digestion after the diced gel is manually transferred to a microtube. In this study, we developed an alternative way to crush the pre-fractionated gel slice into small and irregular-shaped gels by centrifugal extrusion of the sliced gel from the narrow cavity of a pipette tip. As a result, we observed an improved recovery and reproducibility of digested proteins compared to the conventional method of manual dicing. We believe that this simple and rapid method of crushing polyacrylamide gels, which allows for parallel operations and automation, is useful for GeLC/MS/MS analysis and applicable to other approaches including top-down proteomics. Abstract Figure

Abstract We have developed a one-step isolation method for protein N-terminal peptides from LysargiNase digests by pipette tip-based strong cation exchange (SCX) chromatography. This CHAMP-N (CHromatographic AMplification of Protein N-terminal peptides) method using disposable and parallel-processable SCX tips instead of conventional HPLC SCX columns facilitates simple, sensitive and high-throughput N-terminomic profiling without sacrificing the high identification numbers and selectivity achieved by the HPLC-based method. By applying the CHAMP-N method to HEK293T cells, we identified novel cleavage sites for signal and transit peptides, and non-canonical translation initiation sites. Finally, for proteome-wide terminomics, we present a simple and comprehensive N-and C-terminomics platform employing three different tip-based approaches, including CHAMP-N, in which protease digestion and one-step isolation by tip LC are commonly used to achieve complementary terminome coverages.

Summary In this comprehensive study, we present an innovative analytical platform designed to capture the temporal shifts in both the proteome and protein N-terminome during beige adipocyte differentiation. Employing a refined N-terminomics technique, we achieved a high purity of 97% in isolating protein N-terminal peptides. Our data encompassed 7,171 unique N-terminal peptides, with 3,043 from canonical proteins and 4,129 with neo-N-termini. Strikingly, nearly half (44%) of the proteins revealed distinct temporal trajectories between the global proteome and the N-terminome. This underscores the central role of proteolysis in beige adipocyte differentiation. Experimentally, knockdown of either Pmpcb, Plg, or Cstd in preadipocytes attenuated thermogenesis, manifested by reduced levels of beige adipocyte markers like Cidea, Pgc1a, Ucp1, and Tbx1 and an increase in adipogenic proteins, thereby hampering beige adipocyte maturation. A salient discovery was the non-apoptotic role of caspase 8 protease; inhibiting its proteolytic action amplified Ucp1 expression levels. Collectively, our findings spotlight proteases and their proteolytic by-products as vital regulators in beige adipocyte differentiation.