Abstract Plastid biogenesis and the coordination of plastid and nuclear genome expression through anterograde and retrograde signaling are essential for plant development. GENOMES UNCOUPLED1 (GUN1) plays a central role in retrograde signaling during early plant development. The putative function of GUN1 has been extensively studied, but its molecular function remains controversial. Here, we evaluate published transcriptome data and generate our own data from gun1 mutants grown under signaling relevant conditions to show that editing and splicing are not relevant for GUN1-dependent retrograde signaling. Our study of the plastid (post)-transcriptome of gun1 seedlings with white and pale cotyledons demonstrates that GUN1 deficiency significantly alters the entire plastid transcriptome. By combining this result with a PPR code-based prediction and experimental validation by RNA immunoprecipitation experiments, several targets of GUN1 were identified, including 23S rRNA, tRNAs and RNAs derived from ycf1.2 and the ndhH - ndhA - ndhI - ndhG - ndhE - psaC - ndhD gene cluster. The absence of plastid rRNAs and the significant reduction of almost all plastid transcripts in white gun1 mutants account for the cotyledon phenotype. Our study identifies RNA binding and maturation as the long-sought molecular function of GUN1 and resolves long-standing controversies. We anticipate that our findings will serve as a basis for subsequent studies investigating the mechanism of plastid gene expression and will facilitate the elucidation of GUN1’s function in retrograde signaling.

Arabidopsis thaliana is capable of producing photosynthetic tissue with active chloroplasts at temperatures as low as 4°C, and this process depends on the presence of the nuclear-encoded, chloroplast-localized RNA-binding protein CP29A. In this study, we demonstrate that CP29A undergoes phase separation in vitro and in vivo in a temperature-dependent manner, which is mediated by a prion-like domain (PLD) located between the two RNA recognition motif (RRM) domains of CP29A. The resulting droplets display liquid-like properties and are found in close proximity to chloroplast nucleoids. The PLD is required to support chloroplast RNA splicing and translation in cold-treated tissue. Together, our findings suggest that plant chloroplast gene expression is compartmentalized by inducible condensation of CP29A at low temperatures, a mechanism that could play a crucial role for plant cold resistance.

The chloroplast genome encodes key components of the photosynthetic light reaction machinery and the large subunit of the enzyme central for carbon fixation, RuBisCo. Plants constantly face the challenge of balancing light and dark reactions under varying environmental conditions. Nuclear RNA binding proteins (RBPs) play a crucial role in plant acclimation to these changes through post-transcriptional processes. Mutants of chloroplast gene expression factors often exhibit impaired chloroplast biogenesis, especially in cold conditions. Cold temperatures pose a challenge for plants as they slow down Calvin Cycle enzymes, potentially leading to a shortage of electron acceptors and oxidative damage from excess electrons in the thylakoid membrane. A well-known response of plants to this problem is to increase the production of RuBisCo and other Calvin Cycle enzymes in the cold. The chloroplast RNA binding protein CP29A targets rbcL mRNA and is essential for cold resistance in Arabidopsis thaliana. This effect is confined to the youngest leaf tissue and is linked to its role in enhancing the splicing of various chloroplast RNAs in cold conditions. In this study, we utilized enhanced cross-linking and immunoprecipitation (eCLIP) and RNA-Bind-N-Seq (RBNS) to investigate the RNA targets of CP29A, achieving nucleotide-resolution insights into protein-RNA interaction sites. We discovered that CP29A preferentially binds to mRNAs encoding subunits of photosystem II. Notably, one of the most confidently identified targets of CP29A is the 59-UTR of rbcL, where it interacts with a site downstream of the pentatricopeptide repeat protein MRL1, a crucial player in rbcL accumulation. Arabidopsis mutants lacking CP29A showed no significant rbcL changes, possibly due to CP29A9s restricted role in a limited number of cells at the base of leaves. In contrast, CRISPR mutants of tobacco NtCP29A exhibit photosynthetic deficiencies throughout the entire leaf blade, correlating with a substantial decrease in both rbcL mRNA and RbcL protein levels. Conclusively, our study establishes CP29A as a pioneer regulator in sustaining optimal RuBisCo expression during cold acclimation, highlighting its integral role in plant cold response mechanisms.

Chloroplast RNAs are stabilized and processed by a multitude of nuclear-encoded RNA binding proteins, often in response to external stimuli like light and temperature. A particularly interesting RNA based regulation occurs with the psbA mRNA, which shows light-dependent translation. Recently, the chloroplast ribonucleoprotein CP33B was identified as a ligand of the psbA mRNA. We here characterized the interaction of CP33B with chloroplast RNAs in greater detail using a combination of RIP-chip, quantitative dot-blot, and RNA-Bind-n-Seq experiments. We demonstrate that CP33B prefers psbA over all other chloroplast RNAs and associates with vast majority of the psbA transcript pool. The RNA sequence target motif determined in vitro does not fully explain CP33Bs preference for psbA, suggesting that there are other determinants of specificity in vivo.

Plastid biogenesis and the coordination of plastid and nuclear genome expression through anterograde and retrograde signaling are essential for plant development. GENOMES UNCOUPLED1 (GUN1) plays a central role in retrograde signaling during early plant development. The putative function of GUN1 has been extensively studied, but its molecular function remains controversial. Here, we evaluate published transcriptome data and generate our own data from gun1 mutants grown under signaling relevant conditions to show that editing and splicing are not relevant for GUN1-dependent retrograde signaling. Our study of the plastid (post)-transcriptome of gun1 seedlings with white and pale cotyledons demonstrates that GUN1 deficiency significantly alters the entire plastid transcriptome. By combining this result with a PPR code-based prediction and experimental validation by RNA immunoprecipitation experiments, several putative targets of GUN1 were identified, including tRNAs and RNAs derived from ycf1.2, rpoC1 and rpoC2, and the ndhH-ndhA-ndhI-ndhG-ndhE-psaC-ndhD gene cluster. The absence of plastid rRNAs and the significant reduction of almost all plastid transcripts in white gun1 mutants account for the cotyledon phenotype. Our study provides evidence for RNA binding and maturation as the long-sought molecular function of GUN1 and resolves long-standing controversies. We anticipate that our findings will serve as a basis for subsequent studies investigating the mechanism of plastid gene expression and will facilitate the elucidation of GUN1's function in retrograde signaling.

Abstract Chloroplast RNA metabolism is characterized by long-lived mRNAs that undergo a multitude of post-transcriptional processing events. Chloroplast RNA accumulation responds to environmental cues, foremost light and temperature. A large number of nuclear-encoded RNA-binding proteins (RBPs) are required for chloroplast RNA metabolism, but we do not yet know how chloroplast RBPs convert abiotic signals into gene expression changes. Previous studies showed that the chloroplast ribonucleoprotein 31A (CP31A) is required for the stabilization of multiple chloroplast mRNAs in the cold, and that the phosphorylation of CP31A at various residues within its N-terminal acidic domain (AD) can alter its affinity for RNA in vitro . Loss of CP31A leads to cold sensitive plants that exhibit bleached tissue at the center of the vegetative rosette. Here, by applying RIP-Seq, we demonstrated that CP31A shows increased affinity for a large number of chloroplast RNAs in vivo in the cold. Among the main targets of CP31A were RNAs encoding subunits of the NDH complex and loss of CP31A lead to reduced accumulation of ndh transcripts. Deletion analyses revealed that cold-dependent RNA binding and cold resistance of chloroplast development both depend on the AD of CP31A. Together, our analysis established the AD of CP31A as a key mediator of cold acclimation of the chloroplast transcriptome. One sentence summary Cold exposure induces increased RNA association of the RRM protein CP31A, which mediates cold-resistance of Arabidopsis thaliana via its acidic domain