The analysis of cell-free DNA (cfDNA) in plasma represents a rapidly advancing field in medicine, providing information on pathological processes in the body. Blood cfDNA is in the form of nucleosomes, which maintain their tissue- and cancer-specific epigenetic state. We developed EPINUC, a single-molecule multi-parametric assay to comprehensively profile the E pigenetics of P lasma I solated Nuc leosomes, DNA methylation and cancer-specific protein biomarkers. Our system allows high-resolution detection of six active and repressive histone modifications, their ratios and combinatorial patterns, on millions of individual nucleosomes by single-molecule imaging. In addition, it provides sensitive and quantitative data on plasma proteins, including detection of non-secreted tumor-specific proteins such as mutant p53. Applying this analysis to a cohort of plasma samples detected colorectal cancer at high accuracy and sensitivity, even at early stages. Finally, combining EPINUC with direct single-molecule DNA sequencing revealed the tissue-of-origin of colorectal, pancreatic, lung and breast tumors. EPINUC provides multi-layered clinical-relevant information from limited liquid biopsy material, establishing a novel approach for cancer diagnostics.

Abstract Cancer-associated mutations in genes encoding histones dramatically reshape chromatin and support tumorigenesis. Lysine to methionine substitution of residue 27 on histone H3 (K27M) is a driver mutation in high-grade pediatric gliomas, known to abrogate Polycomb Repressive Complex 2 (PRC2) activity. We applied single-molecule systems to image individual nucleosomes and delineate the combinatorial epigenetic patterns associated with H3-K27M expression. We found that chromatin marks on H3-K27M-mutant nucleosomes are dictated both by their incorporation preferences and by intrinsic properties of the mutation. Mutant nucleosomes not only preferentially bind PRC2, but also directly interact with MLL1, thus leading to genome-wide redistribution of H3K4me3. H3-K27M-mediated deregulation of both repressive and active chromatin marks leads to unbalanced ‘bivalent’ chromatin, which may support a poorly differentiated cellular state. This study provides evidence for a direct effect of H3-K27M oncohistone on the MLL1-H3K4me3 pathway and highlights the capability of single-molecule tools to reveal mechanisms of chromatin deregulation in cancer.

Summary Cancer cells are highly heterogeneous at the transcriptional level and in their epigenetic state. Methods to study epigenetic heterogeneity are limited in throughput and information obtained per cell. Here, we adapted Cytometry by Time of Flight (CyTOF) to analyze a wide panel of histone modifications in primary tumor-derived lines of Diffused Intrinsic Pontine Glioma (DIPG). DIPG is a lethal glioma, driven by histone H3 lysine 27 mutation (H3-K27M). We identified two epigenetically distinct subpopulations in DIGP, reflecting inherent heterogeneity in expression of the mutant histone. These two subpopulations are robust across tumor lines derived from different patients and show differential proliferation capacity and expression of stem-cell and differentiation markers. Moreover, we demonstrate the use of this high-dimensional data to elucidate potential interactions between histone modifications and epigenetic alterations during the cell-cycle. Our work establishes new concepts for the analysis of epigenetic heterogeneity in cancer that could be applied to diverse biological systems.

Abstract Downregulation of the urea cycle enzyme argininosuccinate synthase (ASS1) in multiple tumors is associated with a poor prognosis partly because of the metabolic diversion of cytosolic aspartate for pyrimidine synthesis, supporting proliferation and mutagenesis owing to nucleotide imbalance. Here, we find that prolonged loss of ASS1 promotes DNA damage in colon cancer cells and fibroblasts from subjects with citrullinemia type I. Following acute induction of DNA damage with doxorubicin, ASS1 expression is elevated in the cytosol and the nucleus with at least a partial dependency on p53; ASS1 metabolically restrains cell cycle progression in the cytosol by restricting nucleotide synthesis. In the nucleus, ASS1 and ASL generate fumarate for the succination of SMARCC1, destabilizing the chromatin-remodeling complex SMARCC1–SNF5 to decrease gene transcription, specifically in a subset of the p53-regulated cell cycle genes. Thus, following DNA damage, ASS1 is part of the p53 network that pauses cell cycle progression, enabling genome maintenance and survival. Loss of ASS1 contributes to DNA damage and promotes cell cycle progression, likely contributing to cancer mutagenesis and, hence, adaptability potential.

Summary The analysis of cell-free tumor DNA (ctDNA) and proteins in the blood of cancer patients potentiates a new generation of non-invasive diagnostics and treatment monitoring approaches. However, confident detection of these tumor-originating markers is challenging, especially in the context of brain tumors, in which extremely low amounts of these analytes circulate in the patient’s plasma. Here, we applied a sensitive single-molecule technology to profile multiple histone modifications on millions of individual nucleosomes from the plasma of Diffuse Midline Glioma (DMG) patients. The system reveals epigenetic patterns that are unique to DMG, significantly differentiating this group of patients from healthy subjects or individuals diagnosed with other cancer types. We further develop a method to directly capture and quantify the tumor-originating oncoproteins, H3-K27M and mutant p53, from the plasma of children diagnosed with DMG. This single-molecule system allows for accurate molecular classification of patients, utilizing less than 1ml of liquid-biopsy material. Furthermore, we show that our simple and rapid detection strategy correlates with MRI measurements and droplet-digital PCR (ddPCR) measurements of ctDNA, highlighting the utility of this approach for non-invasive treatment monitoring of DMG patients. This work underscores the clinical potential of single-molecule-based, multi-parametric assays for DMG diagnosis and treatment monitoring.

Diffuse midline gliomas (DMGs) are aggressive and fatal pediatric tumors of the central nervous system that are highly resistant to treatments. Lysine to methionine substitution of residue 27 on histone H3 (H3-K27M) is a driver mutation in DMGs, reshaping the epigenetic landscape of these cells to promote tumorigenesis. H3-K27M gliomas are characterized by deregulation of histone acetylation and methylation pathways, as well as the oncogenic MYC pathway. In search of effective treatment, we examined the therapeutic potential of dual targeting of histone deacetylases (HDACs) and MYC in these tumors. Treatment of H3-K27M patient-derived cells with Sulfopin, an inhibitor shown to block MYC-driven tumors in vivo, in combination with the HDAC inhibitor Vorinostat, resulted in substantial decrease in cell viability. Moreover, transcriptome and epigenome profiling revealed synergistic effect of this drug combination in downregulation of prominent oncogenic pathways such as mTOR. Finally, in vivo studies of patient-derived orthotopic xenograft models showed significant tumor growth reduction in mice treated with the drug combination. These results highlight the combined treatment with PIN1 and HDAC inhibitors as a promising therapeutic approach for these aggressive tumors.

Abstract Diffuse midline gliomas (DMG) are aggressive and fatal pediatric tumors of the central nervous system that are highly resistant to treatments. Lysine to methionine substitution of residue 27 on histone H3 (H3-K27M) is a driver mutation in DMGs, reshaping the epigenetic landscape of these cells to promote tumorigenesis. H3-K27M gliomas are characterized by deregulation of histone acetylation and methylation pathways, as well as the oncogenic MYC pathway. In search of effective treatment, we examined the therapeutic potential of dual targeting of histone deacetylases (HDACs) and MYC in these tumors. Treatment of H3-K27M patient-derived cells with Sulfopin, an inhibitor shown to block MYC-driven tumors in-vivo , in combination with the HDAC inhibitor Vorinostat, resulted in substantial decrease in cell viability. Moreover, transcriptome and epigenome profiling revealed synergistic effect of this drug combination in downregulation of prominent oncogenic pathways such as mTOR. Finally, in-vivo studies of patient-derived orthotopic xenograft models showed significant tumor growth reduction in mice treated with the drug combination. These results highlight the combined treatment with PIN1 and HDAC inhibitors as a promising therapeutic approach for these aggressive tumors.

Abstract Diffuse large B cell lymphomas and follicular lymphomas show recurrent mutations in epigenetic regulators; among these are loss-of-function mutations in KMT2D and gain-of-function mutations in EZH2. To systematically explore the effects of these mutations on the wiring of the epigenetic network, we applied a single-cell approach to probe a wide array of histone modifications. We show that mutant-EZH2 elicits extensive effects on the epigenome of lymphomas, beyond alterations to H3K27 methylations, and is dominant over KMT2D mutations. Utilizing the single-cell data, we present computational methods to measure epigenetic heterogeneity. We identify an unexpected characteristic of mutant-EZH2, but not KMT2D, in increasing heterogeneity, shedding light on a novel oncogenic mechanism mediated by this mutation. Finally, we present tools to reconstruct known interactions within the epigenetic network, as well as reveal potential novel cross talk between various modifications, validated by functional perturbations. Our work highlights novel roles for mutant-EZH2 in lymphomagenesis and establishes new concepts for measuring epigenetic heterogeneity and intra-chromatin connectivity in cancer cells.