The current model of the mammalian circadian oscillator is predominantly based on data from genetics and biochemistry experiments, while the cell biology of circadian clocks is still in its infancy. Here, we describe a new strategy for the efficient generation of knock-in reporter cell lines using CRISPR technology that is particularly useful for lowly or transiently expressed genes, such as those coding for circadian clock proteins. We generated single and double knock-in cells with endogenously expressed PER2 and CRY1 fused to fluorescent proteins, which allowed to simultaneously monitor the dynamics of CRY1 and PER2 proteins in live single cells. Both proteins are highly rhythmic in the nucleus of human cells with PER2 showing a much higher amplitude than CRY1. Surprisingly, CRY1 protein is nuclear at all circadian times indicating the absence of circadian gating of nuclear import. Furthermore, in the nucleus of individual cells CRY1 abundance rhythms are phase-delayed (~5 hours), and CRY1 levels are much higher (>6 times) compared to PER2 questioning the current model of the circadian oscillator. Our knock-in strategy will allow the generation of additional single, double or triple knock-in cells for circadian clock proteins, which should greatly advance our understanding about the cell biology of circadian clocks.

Summary Most mammalian cells possess molecular circadian clocks generating widespread rhythms, e.g. in transcript and protein abundance. While circadian clocks are robust to fluctuations in the cellular environment, little is known about how circadian period is compensated for fluctuating metabolic states. Here, we exploit the heterogeneity of single cells both in circadian period and metabolic state, governing protein stability, to study their interdependence without the need for genetic manipulation. We generated cells expressing key circadian proteins (CRY1/2 and PER1/2) as endogenous fusions with fluorescent proteins and simultaneously monitored circadian rhythms and degradation in thousands of single cells. We found that the circadian period is compensated for fluctuations in the turnover rates of circadian repressor proteins and uncovered possible mechanisms using a mathematical model. In addition, the stabilities of the repressor proteins are circadian phase-dependent and correlate with the circadian period in a phase-dependent manner, in contrast to the prevailing model.

Abstract Nonsense-mediated mRNA decay (NMD) has been intensively studied as a surveillance pathway that degrades erroneous transcripts arising from mutations or RNA processing errors. While additional roles in controlling regular mRNA stability have emerged, possible functions in mammalian physiology in vivo have remained unclear. Here, we report a novel conditional mouse allele that allows converting the NMD effector nuclease SMG6 from wild-type to nuclease domain-mutant protein. We analyzed how NMD downregulation affects the function of the circadian clock, a system known to require rapid mRNA turnover. We uncover strong lengthening of free-running circadian periods for liver and fibroblast clocks, and direct NMD regulation of Cry2 mRNA, encoding a key transcriptional repressor within the rhythm-generating feedback loop. In the entrained livers of Smg6 mutant animals we reveal transcriptome-wide alterations in daily mRNA accumulation patterns, altogether expanding the known scope of NMD regulation in mammalian gene expression and physiology.

Abstract Caveolae are specialized invaginations of the plasma membrane that are formed by the co-assembly of caveolin integral membrane proteins and a cytoplasmic cavin coat complex. Previous work has proposed an interaction of the cavin coat protein, CAVIN3, with the key circadian clock protein, PER2. Here we show that cavin proteins can play a role in the regulation of the circadian clock by external stimuli. Loss of Cavin1 in mice caused a shortening of the free-running period of locomotor activity. CAVIN1 and CAVIN3 were found to play a central role in core clock dynamics with either cavin protein directly interacting with PER2 and their perturbation leading to significant disruption in core clock mRNA expression and CRY1 protein oscillation. In cells, association of cavins and PER2 was increased upon caveola disassembly caused by oxidative stress or by calcium influx, stimuli linked to circadian clock regulation. We thus propose that the caveola system can play a modulatory role in circadian regulation through the cavin proteins.

Abstract Three parameters are important to characterize a circadian and in general any biological clock: period, phase and amplitude. While circadian periods have been shown to correlate with entrainment phases, and clock amplitude influences the phase response of an oscillator to pulse-like zeitgeber signals, the co-modulations of amplitude and periods, which we term twist, have not been studied in detail. In this paper we define two concepts: parametric twist refers to amplitude-period correlations arising in ensembles of self-sustained clocks in the absence of external inputs, and phase space twist refers to the co-modulation of an individual clock’s amplitude and period in response to external zeitgebers. Our findings show that twist influences the interaction of oscillators with the environment, facilitating entrainment, fastening recovery to pulse-like perturbations or modifying the response of an individual clock to coupling. This theoretical framework might be applied to understand the emerging properties of other oscillating systems.