The multidrug-resistant bacterium Enterococcus faecium has become increasingly tolerant to the alcohols in hospital disinfectants.

Abstract Alcohol-based hand rubs are international pillars of hospital infection control, restricting transmission of pathogens such as Staphylococcus aureus . Despite this success, health care infections caused by Enterococcus faecium (Efm) - another multidrug resistant pathogen - are increasing. We tested alcohol tolerance of 139 hospital Efm isolates, obtained between 1997 and 2015 and found Efm post-2010 were 10-fold more tolerant to alcohol killing than older isolates. Using a mouse infection control model, we then showed that alcohol tolerant Efm resisted standard 70% isopropanol surface disinfection and led to gastrointestinal colonization significantly more often than alcohol sensitive Efm. We next looked for bacterial genomic signatures of adaptation. Tolerant Efm have independently accumulated mutations modifying genes involved in carbohydrate uptake and metabolism. Mutagenesis confirmed their roles in isopropanol tolerance. These findings suggest bacterial adaptation and complicate infection control recommendations. Additional policies and procedures to prevent Efm spread are required.

Abstract Ross River Virus and Barmah Forest Virus infections (alphaviruses) have short incubation periods and are transmitted to humans by mosquitoes. Mycobacterium ulcerans infection (Buruli ulcer) has a much longer incubation period and its mode of transmission is contested. We studied the relationship between month of notification of alphavirus infections and Buruli ulcer in the temperate Australian state of Victoria over the six-year period, 2017-2022. Using cross-correlation , a signal processing technique, we found that a five-month temporal shift in month of Buruli ulcer notification provided optimal alignment with month of alphavirus notification. This closely matches the previously determined 5-month Buruli ulcer incubation period. Inferred transmission of both conditions showed coordinated maxima in summer and autumn and coordinated minima in winter and spring. The close alignment in season of transmission of alphavirus infection and Buruli ulcer in Victoria supports mosquitoes as the primary local vector of M. ulcerans .

ABSTRACT Buruli ulcer (BU) is a neglected tropical disease caused by infection of subcutaneous tissue with Mycobacterium ulcerans . BU is commonly reported across rural regions of Central and West Africa but has been increasing dramatically in temperate southeast Australia around the major metropolitan city of Melbourne. Previous research has shown that Australian native possums are reservoirs of M. ulcerans and that they shed the bacteria in their fecal material (excreta). Field surveys show that locales where possums harbor M. ulcerans overlap with human cases of BU, raising the possibility of using possum excreta surveys to predict the risk of disease occurrence in humans. We thus established a highly structured 12-month possum excreta surveillance program across an area of 350 km 2 in the Mornington Peninsula area 70 km south of Melbourne, Australia. The primary objective of our study was to assess if M. ulcerans surveillance of possum excreta provided useful information for predicting future human BU case locations. Over two sampling campaigns in summer and winter, we collected 2282 possum excreta specimens of which 11% were PCR positive for M. ulcerans -specific DNA. Using the spatial scanning statistical tool SatScan , we observed non-random, co-correlated clustering of both M. ulcerans positive possum excreta and human BU cases. We next trained a statistical model with the Mornington Peninsula excreta survey data to predict the future likelihood of human BU cases occurring in the region. By observing where human BU cases subsequently occurred, we show that the excreta model performance was superior to a null model trained using the previous year’s human BU case incidence data (AUC 0.66 vs 0.55). We then used data unseen by the excreta-informed model from a new survey of 661 possum excreta specimens in Geelong, a geographically separate BU endemic area to the southwest of Melbourne, to prospectively predict the location of human BU cases in that region. As for the Mornington Peninsula, the excreta-based BU prediction model outperformed the null model (AUC 0.75 vs 0.50) and pinpointed specific locations in Geelong where interventions could be deployed to interrupt disease spread. This study highlights the One Health nature of BU by confirming a quantitative relationship between possum excreta shedding of M. ulcerans and humans developing BU. The excreta survey-informed modeling we have described will be a powerful tool for efficient targeting of public health responses to stop BU.

Abstract Critical scientific questions remain regarding infection with Mycobacterium ulcerans , the organism responsible for the neglected tropical disease, Buruli ulcer (BU). A controlled human infection model has the potential to accelerate our knowledge of the immunological correlates of disease, to test prophylactic interventions and novel therapeutics. Here we present microbiological evidence supporting M. ulcerans JKD8049 as a suitable human challenge strain. This non-genetically modified Australian isolate is susceptible to clinically relevant antibiotics, can be cultured in animal-free and surfactant-free media, can be enumerated for precise dosing, and has stable viability following cryopreservation. Infectious challenge of humans with JKD8049 is anticipated to imitate natural infection, as M. ulcerans JKD8049 is genetically stable following in vitro passage and produces the key virulence factor, mycolactone. Also reported are considerations for the manufacture, storage, and administration of M. ulcerans JKD8049 for controlled human infection.

ABSTRACT In Australia, native possums are an animal reservoir for Mycobacterium ulcerans , the causative agent of Buruli ulcer, a neglected tropical skin disease that can progress to extensive ulceration with deformity and disability. Surveillance of possum excreta for shedding of M. ulcerans can be used to inform geospatial modelling to predict locations at which humans are at increased risk of disease acquisition. This discovery provides opportunities to disrupt transmission pathways. However, the significant expense of commercial kits used for DNA extraction from environmental samples in large scale surveillance studies can hinder implementation of public health measures. To address this barrier, we developed a low-cost method for extraction of nucleic acids from possum excreta, possum tissue swabs, and mycobacterial cultures, using a guanidinium thiocyanate lysis solution and paramagnetic beads for DNA clean-up. In 96-well plate format for high-throughput processing, the SPRI-bead DNA extraction method for possum excreta was 3-fold less sensitive but only 1/6 the cost of a widely used commercial kit. While a SPRI-bead microtube-based extraction method for tissue swabs sampled from possums was 4-fold more sensitive and 1/5 the cost of the corresponding commercial kit. Furthermore, when used for preparing DNA from pure mycobacterial cultures, the SPRI-bead method produced genomic DNA with quality metrics comparable to more laborious techniques. The methods described here provide an economical means to continue large-scale M. ulcerans environmental surveillance that should facilitate efforts to halt the spread of Buruli ulcer in Victoria, Australia, with potential for applicability in other endemic countries. IMPORTANCE Buruli ulcer is a neglected tropical skin disease, with an incidence that has dramatically increased in temperate southeastern Australia over the last decade. In this region of the world Buruli ulcer is a zoonosis, Australian native possums are a major wildlife reservoir of the causative agent, Mycobacterium ulcerans , and mosquitoes the vector to humans. Infected possums shed M. ulcerans in their excreta, and excreta surveys using PCR to screen for the presence of pathogen DNA are a powerful means to predict future areas of Buruli ulcer risk for humans. However, excreta surveys across large geographic areas require testing of many thousands of samples. The cost of commercial DNA extraction reagents used for preparing samples for PCR testing can become prohibitive to effective surveillance. Here, we describe a simple, low-cost method for extracting DNA from possum excreta using paramagnetic beads. The method is versatile and adaptable to a variety of other sample types including swabs collected from possum tissues and pure cultures of mycobacteria.

ABSTRACT Fundamental to effective Legionnaires’ disease outbreak control is the ability to rapidly identify the environmental source(s) of the causative agent, Legionella pneumophila . Genomics has revolutionised pathogen surveillance but L. pneumophila has a complex ecology and population structure that can limit source inference based on standard core genome phylogenetics. Here we present a powerful machine learning approach that assigns the geographical source of Legionnaires’ disease outbreaks more accurately than current core genome comparisons. Models were developed upon 534 L. pneumophila genome sequences, including 149 genomes linked to 20 previously reported Legionnaires’ disease outbreaks through detailed case investigations. Our classification models were developed in a cross-validation framework using only environmental L. pneumophila genomes. Assignments of clinical isolate geographic origins demonstrated high predictive sensitivity and specificity of the models, with no false positives or false negatives for 13 out of 20 outbreak groups, despite the presence of within-outbreak polyclonal population structure. Analysis of the same 534-genome panel with a conventional phylogenomic tree and a core genome multi-locus sequence type allelic distance-based classification approach revealed that our machine learning method had the highest overall classification performance – agreement with epidemiological information. Our multivariate statistical learning approach maximises use of genomic variation data and is thus well-suited for supporting Legionnaires’ disease outbreak investigations.

Haemophilus influenzae is a human respiratory pathogen and inhabits the human respiratory tract as its only niche. Despite this, the molecular mechanisms that allow H . influenzae to establish persistent infections of human epithelia are not well understood. Here, we have investigated how H . influenzae adapts to the host environment and triggers the host immune response using a human primary cell-based infection model that closely resembles human nasal epithelia (NHNE). Physiological assays combined with dualRNAseq revealed that NHNE from five healthy donors all responded to H . influenzae infection with an initial, ‘unproductive’ inflammatory response that included a strong hypoxia signature but did not produce pro-inflammatory cytokines. Subsequently, an apparent tolerance to large extracellular and intraepithelial burdens of H . influenzae developed, with NHNE transcriptional profiles resembling the pre-infection state. This occurred in parallel with the development of intraepithelial bacterial populations, and appears to involve interruption of NFκB signalling. This is the first time that large-scale, persistence-promoting immunomodulatory effects of H . influenzae during infection have been observed, and we were able to demonstrate that only infections with live, but not heat-killed H . influenzae led to immunomodulation and reduced expression of NFκB-controlled cytokines such as IL-1β, IL-36γ and TNFα. Interestingly, NHNE were able to re-activate pro-inflammatory responses towards the end of the 14-day infection, resulting in release of IL-8 and TNFα. In addition to providing first molecular insights into mechanisms enabling persistence of H . influenzae in the host, our data further indicate the presence of infection stage-specific gene expression modules, highlighting fundamental similarities between immune responses in NHNE and canonical immune cells, which merit further investigation.

The neglected tropical disease Buruli ulcer (BU) is an infection of subcutaneous tissue with Mycobacterium ulcerans. There is no effective BU vaccine. Here, we assessed an experimental prime-boost vaccine in a low-dose murine tail infection model. We used the enoyl-reductase (ER) domain of the M. ulcerans mycolactone polyketide synthases electrostatically coupled with a previously described TLR-2 agonist-based lipopeptide adjuvant, R4Pam2Cys. Mice were vaccinated and then challenged via tail inoculation with 14-20 colony forming units (CFU) of an engineered bioluminescent strain of M. ulcerans. Mice receiving either the experimental ER vaccine or Mycobacterium bovis Bacille Calmette-Guerin (BCG) were equally well protected, with both groups faring significantly better than non-vaccinated animals (p<0.05). A suite of 29 immune parameters were assessed in the mice at the end of the experimental period. Multivariate statistical approaches were then used to interrogate the immune response data to develop disease-prognostic models. High levels of IL-2 and low IFN-𝝲 produced in the spleen best predicted control of infection across all vaccine groups. Univariate logistic regression then revealed vaccine-specific profiles of protection. High titres of ER-specific IgG serum antibodies together with IL-2 and IL-4 in the draining lymph node (DLN) were associated with protection induced by the experimental ER vaccine. In contrast, high titres of IL-6, TNF-alpha;, IFN-gamma; and IL-10 in the DLN and low IFN-gamma; titres in the spleen were associated with protection following BCG vaccination. This study suggests an effective BU vaccine must induce localised, tissue-specific immune profiles with controlled inflammatory responses at the site of infection.

Abstract Public health agencies are increasingly relying on genomics during Legionnaires’ disease investigations. However, the causative bacterium ( Legionella pneumophila ) has an unusual population structure with extreme temporal and spatial genome sequence conservation. Furthermore, Legionnaires’ disease outbreaks can be caused by multiple L. pneumophila genotypes in a single source. These factors can confound cluster identification using standard phylogenomic methods. Here, we show that a statistical learning approach based on L. pneumophila core genome single nucleotide polymorphism (SNP) comparisons eliminates ambiguity for defining outbreak clusters and accurately predicts exposure sources for clinical cases. We illustrate the performance of our method by genome comparisons of 234 L. pneumophila isolates obtained from patients and cooling towers in Melbourne, Australia between 1994 and 2014. This collection included one of the largest reported Legionnaires’ disease outbreaks, involving 125 cases at an aquarium. Using only sequence data from L. pneumophila cooling tower isolates and including all core genome variation, we built a multivariate model using discriminant analysis of principal components (DAPC) to find cooling tower-specific genomic signatures, and then used it to predict the origin of clinical isolates. Model assignments were 93% congruent with epidemiological data, including the aquarium Legionnaires’ outbreak and three other unrelated outbreak investigations. We applied the same approach to a recently described investigation of Legionnaires’ disease within a UK hospital and observed model predictive ability of 86%. We have developed a promising means to breach L. pneumophila genetic diversity extremes and provide objective source attribution data for outbreak investigations.