In Brief Objective: To evaluate a new 2-step technique for obtaining adequate but short-term parenchymal hypertrophy in oncologic patients requiring extended right hepatic resection with limited functional reserve. Background: Patients presenting with primary or metastatic liver tumors often face the dilemma that the remaining liver tissue may not be sufficient. Preoperative portal vein embolization has thus far been established as the standard procedure for achieving resectability. Methods: Two-staged hepatectomy was performed in patients who preoperatively appeared to be marginally resectable but had a tumor-free left lateral lobe. Marginal respectability was defined as a left lateral lobe to body weight ratio of less than 0.5. In the first step, surgical exploration, right portal vein ligation (PVL), and in situ splitting (ISS) of the liver parenchyma along the falciform ligament were performed. Computed tomographic volumetry was performed before ISS and before completion surgery. Results: The study included 25 patients with primary liver tumors (hepatocellular carcinoma: n = 3, intrahepatic cholangiocarcinoma: n = 2, extrahepatic cholangiocarcinoma: n = 2, malignant epithelioid hemangioendothelioma: n = 1, gallbladder cancer: n = 1 or metastatic disease [colorectal liver metastasis]: n = 14, ovarian cancer: n = 1, gastric cancer: n = 1). Preoperative CT volumetry of the left lateral lobe showed 310 mL in median (range = 197–444 mL). After a median waiting period of 9 days (range = 5–28 days), the volume of the left lateral lobe had increased to 536 mL (range = 273–881 mL), representing a median volume increase of 74% (range = 21%–192%) (P < 0.001). The median left lateral liver lobe to body weight ratio was increased from 0.38% (range = 0.25%–0.49%) to 0.61% (range = 0.35–0.95). Ten of 25 patients (40%) required biliary reconstruction with hepaticojejunostomy. Rapid perioperative recovery was reflected by normalization of International normalized ratio (INR) (80% of patients), creatinine (84% of patients), nearly normal bilirubin (56% of patients), and albumin (64% of patients) values by day 14 after completion surgery. Perioperative morbidity was classified according to the Dindo-Clavien classification of surgical complications: grade I (12 events), grade II (13 events), grade III (14 events, III a: 6 events, III b: 8 events), grade IV (8 events, IV a: 3 events, IV b: 5 events), and grade V (3 events). Sixteen patients (68%) experienced perioperative complications. Follow-up was 180 days in median (range: 60–776 days) with an estimated overall survival of 86% at 6 months after resection. Conclusions: Two-step hepatic resection performing surgical exploration, PVL, and ISS results in a marked and rapid hypertrophy of functional liver tissue and enables curative resection of marginally resectable liver tumors or metastases in patients that might otherwise be regarded as palliative. Twenty-five patients with marginally resectable liver tumors underwent 2-stage extended right hepatectomy utilizing in situ split and right portal vein ligation with completion surgery after lateral lobe hypertrophy of 74% after 9 days in median. This novel technique provides rapid left lateral lobe hypertrophy, allowing safe extended liver resection.

•Glycolytic index in melanoma negatively correlates with response to anti-PD1 therapy•Blocking lactate transport or knock out of glycolytic genes improves checkpoint therapy•Diclofenac blocks the lactate transporters MCT1 and MCT4 in a COX-independent manner•Inhibition of glycolysis by MCT blockade does not impede T cell function SummaryTumor-derived lactic acid inhibits T and natural killer (NK) cell function and, thereby, tumor immunosurveillance. Here, we report that melanoma patients with high expression of glycolysis-related genes show a worse progression free survival upon anti-PD1 treatment. The non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID) diclofenac lowers lactate secretion of tumor cells and improves anti-PD1-induced T cell killing in vitro. Surprisingly, diclofenac, but not other NSAIDs, turns out to be a potent inhibitor of the lactate transporters monocarboxylate transporter 1 and 4 and diminishes lactate efflux. Notably, T cell activation, viability, and effector functions are preserved under diclofenac treatment and in a low glucose environment in vitro. Diclofenac, but not aspirin, delays tumor growth and improves the efficacy of checkpoint therapy in vivo. Moreover, genetic suppression of glycolysis in tumor cells strongly improves checkpoint therapy. These findings support the rationale for targeting glycolysis in patients with high glycolytic tumors together with checkpoint inhibitors in clinical trials. Tumor-derived lactic acid inhibits T and natural killer (NK) cell function and, thereby, tumor immunosurveillance. Here, we report that melanoma patients with high expression of glycolysis-related genes show a worse progression free survival upon anti-PD1 treatment. The non-steroidal anti-inflammatory drug (NSAID) diclofenac lowers lactate secretion of tumor cells and improves anti-PD1-induced T cell killing in vitro. Surprisingly, diclofenac, but not other NSAIDs, turns out to be a potent inhibitor of the lactate transporters monocarboxylate transporter 1 and 4 and diminishes lactate efflux. Notably, T cell activation, viability, and effector functions are preserved under diclofenac treatment and in a low glucose environment in vitro. Diclofenac, but not aspirin, delays tumor growth and improves the efficacy of checkpoint therapy in vivo. Moreover, genetic suppression of glycolysis in tumor cells strongly improves checkpoint therapy. These findings support the rationale for targeting glycolysis in patients with high glycolytic tumors together with checkpoint inhibitors in clinical trials.

Abstract Background and Aims Hepatocellular carcinoma (HCC) is a global health burden with increasing incidence, poor prognosis and limited therapeutic options. Natural killer (NK) cells exhibit potent anti-tumoral activity and therefore represent potential targets for immunotherapeutic approaches in HCC treatment. However, the human NK-cell repertoire is highly diverse including conventional and adaptive NK cells that differ in phenotype and effector function. Adaptive NK-cell frequencies are increased in association with HCMV (human cytomegalovirus) seropositivity that is also common in HCC patients. In this study, we aimed to gain a better understanding of the NK-cell repertoire and the associated anti-tumoral activity in HCC patients. Methods In-depth phenotypic and functional flow-cytometry analyses of the HCMV-associated NK cell-repertoire obtained from 57 HCC patients, 33 liver cirrhosis patients and 36 healthy donors (HD). Results First, adaptive subsets are present in all three cohorts with conserved characteristics in patients with liver cirrhosis and HCC. Second, adaptive NK cells can be isolated from HCC tissue however lack features of tissue-residency and thus probably represent circulating/infiltrating lymphocytes. Third, the anti-tumoral activity by adaptive NK cells is reduced compared to conventional NK-cell subsets, also in HCC. Lastly, frequencies of adaptive NK cells were increased in patients suffering from Hepatitis B virus-associated HCC providing a link between etiology and the NK-cell repertoire in HCC. Conclusion Adaptive NK cells limit the anti-tumoral activitity of NK cells in HCC, especially in association with HBV infection that is accompanied by an expansion of this NK cell subset. Lay summary In patients with liver cancer (HCC), a subset of natural killer cells, so called adaptive NK cells show a diminished anti-tumoral activity compared to other, called conventional NK cells. Adaptive NK cells are expanded in patients with HCC associated to Hepatitis B virus infection. Thus, presence of adaptive NK cells contributes to the immune escape in HCC.

Abstract Background Checkpoint blockade in cholangiocarcinoma (CCA) is promising; however, little is known about the response to treatment in CCA subtypes. In this study, we investigated the spatial immune environment in combination with checkpoint expression in perihilar CCA (pCCA). Materials & Methods The levels of checkpoint molecules (PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, ICOS, TIGIT, TIM-3, and CTLA-4), macrophages (CD68), and T cells (CD4 and CD8) were assessed by multiplex immunofluorescence (mIF) in 50 patients. We investigated the transcriptomic profile using the NanoString Cancer Progression Panel, and validation was performed by mIF on tissue sections from 24 patients. Results The expression of checkpoint molecules TIGIT, CTLA-4, and LAG-3 alone and in combination with other checkpoint molecules was more abundant in the Central Tumor (CT) and Invasive Margin (IM) than in peritumoral tissue (PT) (CD4 and CD8 TIGIT p<0.0001 for both CD4 and CD8 CTLA-4, p<0.0001 and p < 0.001, respectively, and CD8 LAG-3 p < 0.05). MMP2 and MMP14 were differentially expressed in patients with high TIGIT expression. Conclusion The immune environment in pCCA is characterized by the expression of multiple checkpoints, demonstrating the complexity of ICI treatment. High TIGIT expression drives an immunosuppressive environment by modulating the extracellular matrix. Future clinical trials in pCCA could consider TIGIT as a therapeutically relevant target for (combination) treatment.

Background: Extended liver resection is the only treatment option for perihilar cholangiocarcinoma (pCCA). Bile salts and the gut hormone FGF19, both promoters of liver regeneration (LR), have not been investigated in patients undergoing resection for pCCA. We aimed to evaluate the bile salt-FGF19 axis perioperatively in pCCA and study its effects on LR. Methods: Plasma bile salts, FGF19, and C4 (bile salt synthesis marker) were assessed in patients with pCCA and controls (colorectal liver metastases), before and after resection on postoperative days (PODs) 1, 3, and 7. Hepatic bile salts were determined in intraoperative liver biopsies. Results: Partial liver resection in pCCA elicited a sharp decline in bile salt and FGF19 plasma levels on POD 1 and remained low thereafter, unlike in controls, where bile salts rose gradually. Preoperatively, suppressed C4 in pCCA normalized postoperatively to levels similar to those in the controls. The remnant liver volume and postoperative bilirubin levels were negatively associated with postoperative C4 levels. Furthermore, patients who developed postoperative liver failure had nearly undetectable C4 levels on POD 7. Hepatic bile salts strongly predicted hyperbilirubinemia on POD 7 in both groups. Finally, postoperative bile salt levels on day 7 were an independent predictor of LR. Conclusions: Partial liver resection alters the bile salt-FGF19 axis, but its derailment is unrelated to LR in pCCA. Postoperative monitoring of circulating bile salts and their production may be useful for monitoring LR.

ABSTRACT Background B cells and tertiary lymphoid structures (TLS) are reported to be important in the improvement of survival of cancer patients. These secondary lymphoid organs have been associated with the generation of an anti-tumor response. Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) is one of the most lethal cancer types and the stromal architecture shapes the intratumoral heterogeneity. The stroma of PDAC is a complex system in which crosstalk takes place between cancer-associated fibroblasts, immune cells, endothelial cells and the cancer cells. Besides immune cells and fibroblasts, there is some limited data about the influence of nerve fibers on cancer progression. Patients and methods Nerve Fiber Density (NFD) was analysed in our cohort of 188 patients with Pancreatic Ductal Adenocarcinoma who underwent pancreatic surgery. We used immunohistochemistry and multiplex imaging to phenotype the immune cell infiltrate. The cell detection classifier measured distance from immune cell to cancer gland and with a heat map we could count TLS. By using Machine learning we were able to define the spatial distribution and counting Tertiary Lymphoid Structures. Results High NFD is significantly associated with prolonged overall survival (HR 1.676 (95%CI 1.126,2.495) for low vs. high NFD, p-value 0.0109). The immune cells surrounding the nerve fibers were phenotyped in B cells, T cells and dendritic follicular cells, matching a TLS. Here we show that small nerve fibers are located at the TLS in Pancreatic Cancer and a high Nerve Fiber Density combined with more than 5 TLS is associated with a better survival (HR 0.388 (95%CI 0.218, 0.689). Conclusion The co-localization of small nerve fibers with TLS is a new finding which has not been described before. However the precise roles of these TLS and nerve fibers remains unknown. These findings unravel future pathways and has the potential to reach new directions into already existing targeted therapy.

Abstract Background and aims Cholangiocarcinoma (CCA) is a deadly disease, and this cancer entity is characterized by an abundant stroma. The tumor microenvironment (TME) plays an important role in aggressive behavior and poor response to therapeutics; however, underlying pathways are unknown. Methods To fill this gap, we used multiplexed immunohistochemistry, high-dimensional phenotyping, and transcriptomics to analyze human CCA samples and identify cell cluster crosstalk in patients with a poor prognosis. Results Our findings confirmed the presence of Tregs and the lack of effector memory cells in the tumor. New findings are the spatiality of the effector memory cells being more present in the peripheral tissue, for some reason these immune cells fail to reach the tumor niche. We revealed cancer crosstalk with macrophages and stromal cells and identified responsible genes in the poor prognosis group. Amongst the responsible ligand pairs are GAS6-AXL belonging to the TAM family. We then identified VCAN-TLR2 to be present and influencing the ECM in a way to supports immune exhaustion. Last, EGFR-TGF-β is expressed in macrophages and this finding is important in Tregs induction and blocking cytotoxic T cell function. Conclusions The multiple mechanisms leading to the exclusion of relevant immune cells needed for an anti-cancer response and mechanisms leading to active immune suppression are part of complex cell-cell crosstalk. This study provides a deeper insight into the immune exhausted phenotype in CCA.

Abstract Background & Aims Perihilar cholangiocarcinoma (pCCA) is a rare hepatobiliary malignancy. Nerve fiber invasion (NFI) shows cancer invading the nerve and is considered an aggressive feature. Nerve fiber density (NFD) consists of small nerve fibers without cancer invasion and is divided into high NFD (high numbers of small nerve fibers) or low NFD (low numbers of small nerve fibers). We aim to explore differences in immune cell populations and survival. Methods We applied multiplex immunofluorescence (mIF) on 47 pCCA surgically resected patients and investigated the immune cell composition in the tumor microenvironment (TME) of different nerve fiber phenotypes (NFI, high and low NFD). Extensive group comparison was carried out and the association with overall survival (OS) was assessed. Results The NFI ROI was measured with highest CD68+ macrophage levels among 3 ROIs (NFI compared to tumor free p= 0.016 and to tumor p=0.034). Further, for NFI patients the density of co-inhibitory markers CD8+PD1+ and CD68+PD1+ were more abundant in the tumor rather than NFI ROI (p= 0.004 and p= 0.0029 respectively). Comparison between patients with NFD and NFI groups, the signals of co-expression of CD8+PD1+ as well as CD68+PD1+ were significantly higher in the high NFD group (p= 0.027 and p= 0.044, respectively). The OS for high NFD patients was 92 months median OS (95% CI:41-142), for low NFD patients 20 months ((95% CI: 4-36) and for NFI group of patients 19 months (95% CI 7-33). The OS for high NFD patients was significantly better compared to low NFD (p= 0.046) and NFI (p= 0.032). Conclusions PD1+ T-cells correlate with high NFD as a prognostic biomarker, the biological pathway behind this needs to be investigated. Lay summary Nerve fibers play a dual role in the tumor microenvironment in pCCA. In our previous study, we showed that the presence of high numbers of small nerve fibers is associated with a better overall survival. In addition, we found that in high NFD patients PD1+ T-cells are significantly overexpressed. Therefore, we present high NFD as a promising prognostic biomarker. Graphical abstract