Abstract Background Checkpoint blockade in cholangiocarcinoma (CCA) is promising; however, little is known about the response to treatment in CCA subtypes. In this study, we investigated the spatial immune environment in combination with checkpoint expression in perihilar CCA (pCCA). Materials & Methods The levels of checkpoint molecules (PD-1, PD-L1, PD-L2, LAG-3, ICOS, TIGIT, TIM-3, and CTLA-4), macrophages (CD68), and T cells (CD4 and CD8) were assessed by multiplex immunofluorescence (mIF) in 50 patients. We investigated the transcriptomic profile using the NanoString Cancer Progression Panel, and validation was performed by mIF on tissue sections from 24 patients. Results The expression of checkpoint molecules TIGIT, CTLA-4, and LAG-3 alone and in combination with other checkpoint molecules was more abundant in the Central Tumor (CT) and Invasive Margin (IM) than in peritumoral tissue (PT) (CD4 and CD8 TIGIT p<0.0001 for both CD4 and CD8 CTLA-4, p<0.0001 and p < 0.001, respectively, and CD8 LAG-3 p < 0.05). MMP2 and MMP14 were differentially expressed in patients with high TIGIT expression. Conclusion The immune environment in pCCA is characterized by the expression of multiple checkpoints, demonstrating the complexity of ICI treatment. High TIGIT expression drives an immunosuppressive environment by modulating the extracellular matrix. Future clinical trials in pCCA could consider TIGIT as a therapeutically relevant target for (combination) treatment.

Abstract Background and aims Cholangiocarcinoma (CCA) is a deadly disease, and this cancer entity is characterized by an abundant stroma. The tumor microenvironment (TME) plays an important role in aggressive behavior and poor response to therapeutics; however, underlying pathways are unknown. Methods To fill this gap, we used multiplexed immunohistochemistry, high-dimensional phenotyping, and transcriptomics to analyze human CCA samples and identify cell cluster crosstalk in patients with a poor prognosis. Results Our findings confirmed the presence of Tregs and the lack of effector memory cells in the tumor. New findings are the spatiality of the effector memory cells being more present in the peripheral tissue, for some reason these immune cells fail to reach the tumor niche. We revealed cancer crosstalk with macrophages and stromal cells and identified responsible genes in the poor prognosis group. Amongst the responsible ligand pairs are GAS6-AXL belonging to the TAM family. We then identified VCAN-TLR2 to be present and influencing the ECM in a way to supports immune exhaustion. Last, EGFR-TGF-β is expressed in macrophages and this finding is important in Tregs induction and blocking cytotoxic T cell function. Conclusions The multiple mechanisms leading to the exclusion of relevant immune cells needed for an anti-cancer response and mechanisms leading to active immune suppression are part of complex cell-cell crosstalk. This study provides a deeper insight into the immune exhausted phenotype in CCA.